DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS Práctica XXXIII del libro pag:257

DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS

INTRODUCCIÓN

     Las crioglobulinas son inmunoglobulinas aisladas o complejos inmunes que están alterados. Esta alteración hace que se vuelvan insolubles y precipiten en el suero cuando están expuestas a una temperatura inferior a la normal del cuerpo humano ( unos 37 ºC).

     Antes o durante el proceso de precipitación, también se pueden producir una fijación de componentes del complemento a la crioglobulina.

     Se distinguen 3 clases crioglobulinas:

• Crioglobulinas tipo I.

     Consiste en una inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM) (paraproteína)

     Se encuentra en el suero a una concentración (> 5 mg/ml).

• Crioglobulinas tipo II.

     Son complejos de una inmunoglobulina monoclonal  (de clase IgM) y de otra policlonal (generalmente de clase IgG) que funciona como antigeno (Ag).

 
     Se hallan en el suero a una concentración mediana (1-5 mg/ml).

• Crioglobulinas tipo III.

     Son las que se producen más frecuentemente.

     Están formadas por 2 inmunoglobulinas policlónicas (habitualmente una de la clase IgG y otra de la clase IgM). Ademas suelen incluir un componente de complemento.

     Su concentración sérica es muy baja (< 80 microgramos/ml).

METÓDICA

Fundamento

     La detección de crioglobulinas se basa en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja (unos 4 ºC, pues ésta es la temperatura a la que las crioglobulinas precipitan más).

     Si el suero problema contiene crioglobulinas, éstas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta el aspecto de partículas blanquecinas.

Material

• Una pipeta Pasteur.
• Un tubo de ensayo.
• Una gradilla.
• Una nevera.
• Un baño de agua.
• Un capilar de microhematocrito no heparinizado.
• Plastilina.
• Una centrífuga de microhematocrito.
• Una regla o un lector de microhematocrito.

Muestra

• Suero transparente, obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal, y separado del coagulo en un ambiente cálido.

     Es importante evitar que la coagulaciòn se produzaca en un ambiente frío, pues esto puede dar lugar a la formación de una pequeña contidad de crioglobulinas.

Técnica

1. Depositar el suero problema en un tubo de ensayo.
2. Colocar el tubo que contiene el suero problema en una nevera, de forma que esté a una temperartura comprendida entre los 4 y los 6 ºC.
3. Examinar el tubo a los 30 minutos y después cada día, durante 6 días.

 Lectura de resusltados

• Si aparecen partículas blanquecinas en el suero, éste ha de ser incubado a 37 ºC.

     Cuando no desaparecen las partículas, traas la incubación, se considera que éstas se deben a restos de fibrina.
     Sin embargo, cuando las partículas desaparecen, se estima que son crioglobulinas precipitadas (prueba positiva).

• El grado dd positividad de la prueba puede ser establecido de la siguiente manera:

ASPECTO DEL SUERO	GRADO DE POSITIVIDAD
Discretamente turbio	+
Francamente turbio	++
Lechoso	+++

     En el caso de que la prueva sea positiva, puede realizarse una semicuantificación de las crioglobulinas presentes en el suero, mediante determinación del criocrito.

     Éste se mide de la siguiente manera:

1. Llenar un tubo capilar de hematocrito con el suero problema, hasta l las 3/4 partes de su longitud.
2. Sellar con plastilina el extremo del tubo por el que ha entrado el suero.
3. Enfriar el tubo a 4 o 6 ºC, hasta que se produzca la precipitación máxima de las crioglobulinas.
4. Centrifugar el tubo a una 12000 g durante 5 minutos.
5. Calcular el porcentaje que supone la columna de pre ipitado, con respecto a la columna total del suero.

     El criocrito es, por lo tanto, la relación existente entre el volumen ocupado por el precipitado de crioglobulinas y el ocupado por el suero total, expresada en forma de porcentaje.



INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

     Las crioglobulinemias tipo I se asocian a transtornos proliferativos (mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström y leucemia linfática crónica.

     Las crioglobulemias tipo II pueden ser idiopáticas o secundarias a distintas enfermedades (transtornos proliferativos, conectivopatías,  hepatopatías crónicas, etc.).

     Las crioglobulinemias tipo III suelen etar relacionadas con infecciones sistémicas y con procesos autoinmunes (glomerulonefritis, lupus eritomatoso deseminado, etc.).

     Las manifestaciones clínicas de las crioglobulinemias se deben a los siguientes fenómenos originados por ellas:

• Aumento de la viscosidad de la sangre.

     Esto puede conducir a una estasis sanguínea en algunos vasos coporales (por ejemplo, en los retinianos y en los conjuntivales) y contribuye a la aparción de transtornos isquémicos.

• Precipitación de las crioglobulinas.

     Se produce en los vasos sanguíneos más distales, pues en éstos la temperatura normal es algo menos que en el resto del cuerpo (30-31 ºC), y es favorecida por la exposición a temperaturas ambientales bajas.

     Origina una obstrucción vascular, que puede ocasionar una acrocianosis, un fenómeno de Raynaud e incluso una isquemia digital con necrosis.

• Depósito de inmunoclomplejos.

     Puede ser causa de la aparición de daños renales (glomerulonefritis) o articulares.

Hoja de trabajo

1. ¿A qué temperatura se debe someter el suero en una detección de crioglobulinas?. Entre 4 y 6 ªC.
2. Si el precipitado no se reabsobe con calor, ¿de qué sustancia está formado?. Fibrina.
3. ¿Cuantas cruces se le asigna  a un suero que adquiere un aspecto lechoso?. 3 cruces.
4. ¿A qué concentración sérica suelen encontrarse las crioglobulinas tipo I?. A > 5 mg/ml.
5. ¿Qué manifestaciones clínicas puede producir una crioglobulinemia?. Aumento de la viscosidad de la sangre, precipitación de las crioglobulinas, depósito de inmunoclomplejos.

Resultados obtenidos

Después de una hora, no había precipitados, 

Valoración de los resultados

En el suero porblema no hay crioglobulinas

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA Práctica XL pag 348 del libro

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

INTRODUCCIÓN

    Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick).

    Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protrombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP determinado en el plasma problema.

METÓDICA

Fundamento

    Para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una baterúia de diluiciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normas no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.

   Tras ello, se asigna el 100 % de actividad al número en segundos  medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.

    Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina), anotando, en el eje de ordenadas ( el valor vertical), los valores, en segundos, del TP del p`lasma control no diluido y de cada ima de sis diluciones y, en el eje de abcisas (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

Material necesario

•  8 tubos de ensayo de plástico.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una pipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1000 µl) de capacidad de dispensación.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200  µl (las de color amarillo).
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37 ºC.
• Un bolígrafo.
• Una regla.
• Una hoja de papel milimetrado. Tambien se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
• Una gradilla.

Reactivos 

•  Solución salina al 0,85 % o, mejor aún, tampón Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:

      Dietil-barbiturato de sodio.................2,94 g

      Acetato de sodio...............................1,94 g

      Agua destilada c.s.p...........................100 ml

• Una tromboplastina cálcica ( por ejemplo, el reactivo Thromboplastin-D preparado or los laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la casa comercial Ral).
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los laboratorios Pacific Hemostasis).

      A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85 % o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	1/2	1/3	1/4	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

     Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asigando a cada dilución.

Técnica

1. Homogeneizar la trmboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
2. Atemperar la tromboplastina cálcina que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado. 
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37 ºC. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37 ºC,  entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50, el de otra con el 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
6. Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
7. Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37 ºC, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar, sucesivamente, cada una de los 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

     Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

     Cuando se forma el coágulo, el cuagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de los resultados

     El TP es el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

     Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

     Para construir la curva de actividad de la protrombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas de la y (el vertical), los vlores, en segundos, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones, y, en el eje de abscisas o de la x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

     Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.

Columna1	Columna2
100	5
50	21
33	29,3
25	41,7
10	47,6

Hoja de trabajo

1. ¿Con que se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?. Con solución salina al 0,85 %.
2. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?. El 50%.
3. ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?. Al agregar la tromboplatina cálcica.
4. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?. Los segundos.

RECUENTO DE PLAQUETAS EN FROTÍS SANGUÍNEOS Práctica XXXIV del libro

RECUENTO DE PLAQUETAS EN FROTÍS SANGUÍNEOS

INTRODUCCIÓN

    El recuento de plaquetas (PLT o PLQ) consiste en la determinación del número de trombocitos en un volumen determinado de sangre (generalmente, en 1 mm3).

    El recuento de plaquetas puede realizarse, de una forma aproximada, contando los trombocitos presentes en varios campos de una extensión sanguínea observada microscópicamente. Sin embargo, tambien se puede llevar a cabo un recuento de plaquetas más exacto, mediante el empleo de una cámara de recuento o, mejor aún, con contadores electrónicos de células.

    El recuento de plaquetas practicadol mediante el examen de un frotis sanguíneo permite, además, el estudio de la morfología de los trombocitos.

METÓDICA

Material necesario

• Un microscopio.
• Papel.
• Un bolígrafo.

Reactivos

• Líquido de inmersión.

Muestra

• Una extensión de la sangre problema coloreada con un método de tinción tradicional.

Técnica

1º. Observar el frotis sanguíneo con el objetivo de inmersión del microscopio.

2º. Elegir, para su examen, una zona de la preparación sanguínea en la que las células no están superpuestas y en la que se observa la morfología de las mismas.

3º. Contar el número de plaquetas presentes en 10 cmpos microscópicos.

     Para cambiar de campo correctamente y evitar contar los mismos trombocitos, se fija la vista en un punto de uno de los bordes del campo microscópico que se está estudiando (por ejemplo, el borde derecho) y se desliza el portaobjetos hasta que ese punto está en el borde opuesto de un nuevo campo microscópico (en este caso, en el borde izquierdo).

4º. Calcular la cifrea media del número de plaquetas contadas en los 10 campos microscópiccos.

Lectura de resultados

    Para cuantificar, de una forma aproximada, el número de trombocitos comprendidos en uç1 mm3 de sangre, se aplica la siguiente fórmula:

                     PLT/mm3 = PLT/C x 20.000

PLT/mm3 = Número de plaquetas por mm3.

PLT/C = Media del número de plaquetas contadas en varios campos microscópicos (en este caso, en 10).

INTERPRETACIÓN CLINICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

    Cuando se observa una extensión samguínea con el objetivo de inmersión, en condiciones normales, debe haber 1 plaqueta por cada 10-20 hematíes.

    Esto equivale, aproximadamente, a la presencia, en una zona del frotis donde los eritrocitos no estan superpuestos, de 5 a 25 trombocitos por campo

    Cuando el número de plaquetas `pr mm3 de sangre es inferior a 130.000, se dice que hay una trombocitopenia o trombopenia, y, cuando es superior a 400.000, se dice que hay una trombocitosis.

Hoja de trabajo

1º. En condiciones normales, ¿cuántas plaquetas por campo microscópico hay en una zona de un frotis sangíneo donde los eritrocitos no estan superpuestos?.

     De 5 a 25 trombocitos por campo microscópico.

Resultados obtenidos

CAMPO	PLAQUETAS
1	5
2	5
3	7
4	4
5	10
6	14
7	10
8	19
9	11
10	12
	97

PLT/C = 97/10 = 9,7 (media del número de plaquetas contadas)

PLT/mm3 = PLT/C x 20.000 = 9,7 x 20.000 = 194.000 PLT/mm3

• Número de plaquetas contadas en 10 campos microscópicos....97 plaquetas.
• Media del número de plaquetas contadas en 10 campos microscópicos (PLT/C)....9,7 plaquetas.
• Número de plaquetas por mm3 de sangre (PLT/mm3)....194.000 plaquetas/mm3.

Valoración de los resustados

El PLT/mm3 obrtenido implica que el sujeto tiene: Un número de plaquetas normal.

ESTUDIO DE UN CONCENTRADO DE LEUCOCITOS Práctica XXXII del libro

ESTUDIO DE UN CONCENTRADO DE LEUCOCITOS

INTRODUCCIÓN

    En algunas circunstancia está indicada la obtención de un concentrado de leucocitos. Entre ellas cabe destacar las siguientes:

• Obstención y estudio microscópico de células patológicas en una leucopenia.
• Obstención de células en una leucopenia para la realización de pruebas citoquímicas.
• Obstención de para la búsqueda el corpúsculo de Barr. Ëste es la condensación del material genético inactivado de un cromosoma X.

PROCEDIMIENTO

    Cuando se centrifuga sangre anticoagulada a una velocidad y durante u n tiempo adecuados, se obtienen tres capas o fracciones:

• En la capa inferior de color rojo están presentes los eritrocitos.
• La capa meia de color blanco y escaso espesor (buffy coat o capa leucoplaquetaria) está constituida por leucocitos y plaquetas.
• La capa superior, transparente y de color ambarino, es el plasma.

Material necesario

• Un tubo de centrífuga.
• Una centrífuga.
• Una pipeta Pasteur fina.
• 2 portaobjetos.

Reactivos

• Los necesarios para realizar la tinción hematológica seleccionada.

Muestra

• Sangre venosa anticoagulada con citrato sódico. La proporción adecuada de anticoagulante es de 0,5 ml de citrato sódico al 3,2 % por cada 4,5 ml de sangre venosa.

Técnica

1. Mezclar la sangre y el anticoagulante.
2. Centrifugar la sangre anticoagulada, a 1500 r.p.m. y durante 15 minutos.
3. Retirar el sobrenadante obtenido (el plasma).
4. Recoger de 0,2 a 0,3 ml de la capa leucoplaquetaria.Al hacer esto, se ha de tener en cuidado para no recoger ninguna porción de la capa eritrocitaria.
5. Extender varias gotas de la capa leucoplaquetaria, sobre un portaobjetos a modo de frotis.
6. Teñir este frotis mediante una técnica hematológica tradicional (Giemsa, Wrigh, May-Grümwald Giemsa, etc.) o con un método citoquímico.

Lectura de resultados

    La observación microscópica del frotis preparado a partir de la capa leucoplaquetaria per mite el estudio de numerosos leucocitos de todos los tipos. Además, facilita la visualización de múltiples plaquetas.

Hoja de trabajo

1º. ¿Cómo se llama la condensación del material genético inactivado de un cromosoma X?

     Corpúsculo de Barr.

2º. ¿Qué otro nombre recibe la capa leucoplaquetaria?.

     Buffy coat.

3º. Tras centrifugar la sangre, ¿en qué capa se situan los hematíes?.

     En la capa inferior.

Resultados obtenidos

Valoración de los resultados

    En la sangre estudiada:

    No hay leucocitos con alteraciones.

DETERMINACIÓN DEL INDICE DE LOBULARIDAD (IL) Práctica XXIX del libro

DETERMINACÓN DEL ÍNDICE DE LOBULARIDAD (IL)

METÓDICA

Material necesario

• Un microscopio.
• Un bolígrafo.
• Un papel.

Reactivos

• Líquido de inmersión.

Muestra

• Una extensión sanguínea muy fina.

Técnica

1º. Enfocar la extensión sanguínea con el objetivo de inmersión.

2º. Observar los neutrófilos y contar sus lobulaciones.

     Se considera que hay un lóbulo cuando una parte del núcleo está unida al resto solamente por un fino puente de cromatina.

3º. Clasificar los neutrófilos según Arneth (atendiendo al número de lobulaciones de su núcleo), al tiempo que se cuentan los lóbulos de cada neutrófilo observado.

• Tipo I: neutrófilos con un núcleo no segmentado, es decir, sin lobulaciones.
• Tipo II: neutrófilos con un núcleo divido 1 vez, es decir, con 2 lóbulos.
• Tipo III: neutrófilos con un núcleo dividido 2 veces, es decir, con 3 lóbulos.
• Ti`po IV: neutrófilos con un núcleo dividido 3 veces, es decir, con 4 lóbulos.
• TipoV: neutrófilos con un núcleo dividido 4 veces, es decir, con 5 lóbulos.

4º. Terminar el recuento cuando se haya observado al menos 100 neutrófilos.

Lectura de resultados

     Una vez clasificados los neutrófilos, se cuantifican las lobulaciones presentes en ellos y, seguidamente, se calcula el IL mediante la siguiente fórmula:

              IL = NL/NN

IL = Índice de lobularidad

NL = Número de lóbulos contados.

NN = Número de neutrófilos obsrvados (por ejemplo, 100).

             IL = 117/40 = 2,9.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

    . La desviación a la izquierda puede acompañarse de neutrofilia o neutropenia.

      La desviación a la izquierda con neutrofília es típica de muchas infecciones agudas (por ejemplo, apendicitis, sepsis, etc.).

      La desviación a la izquierda con neutropenia es característica de ptras infecciones (por ejemplo, fiebre tifoidea, brucelosis, etc.).

    . La desviación a la derecha ùede darse en varios procesos patológicos,  entre los que destacan las anemias megaloblásticas. Curiosamente, esta alteración también se produce en la agonía.

Hoja de trabajo

1º. ¿Cuántos tipos de neutrófilos hay según Arneth?

     5 tipos.

2º. ¿Qué tipo de desviación hay si el IL es igual a 2,5?.

     Ninguna, Ya que el valor normal se considera desde 1,9 a 3.

3º. ¿De qué enfermedades es típica la desviación a la izquierda con neutrofilia?.

     La desviación a la izquierda con neutrofília es típica de muchas infecciones agudas (por ejemplo, apendicitis, sepsis, etc.)

Resultados obtenidos

Tipo de neutrófilo	Número de neutrófilos que Pertenecen a ese tipo
I	1
II	14
III	15
IV	7
V	3
	40	Número total de neutrófilos               observados

-. Número total de lobulaciones cuantificadas: 

    117.

-. Indice de lobularidad:

   2,9.

Valoración de los resultados

.- En la sangre estudiada:

   No hay ningún tipo de desviación.

RECUENTO DE PLAQUETAS CON HEMATOCITÓMETRO Práctica XXV del libro

RECUENTO DE PLAQUETAS CON HEMACITÓMETRO

METODICA

Fundamento

    Para el recuento en cámara de plaquetas, se diluye la sangre problema en un líquido apropiado y posteriormente, se deposita en la cámara de recuento, donde se cuentan las células presente en alguno de los cuadrados de uno de los retículos.

Material necesario

• Un  tubo de ensayo, preferentemente, de plástico.
• Una pipeta diluidora de Thoma, para recuento de glóbulos rojos.
• Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.
• Gasas.
• Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer mejorado.
• Un cubreobjetos, preferentemente, del tipo especialmente diseñado para su uso en recuentos con cámara.
• Un microscopio, preferentemente, de contraste de fases.
• una placa de Petri.
• Papel de filtro.

Reactivos

• Agua destilada o desionizada.
• Líquido de dilución. Hay varios líquidos, pero se recomienda e líquido de dilución suministrado por los laboratorios Spinreact. Este líquido rompe los hematíes, evita la agregación de las plaquetas entre sí y su adhesión a otros elementos, y facilita la visualización de las plaquetas al hacerlas refringentes.

Muestra

• Sangre capilar o sangre venosa extraída recientemente y recogida en un tubo con EDTA-K3.

Técnica

1º. Verter, en un tubo de ensayo, el volumen necesario de líquido de dilución para efectuar los ensayos requeridos (aproximadamente, 1 ml para cada determinación).

    El volumen de líquido de dilución sobrante no ha de reintegrarse al frasco donde estaba envasado, para no contaminar al resto del líquido de dilución.

2º. Con una pipeta diluidora de tipo Thoma, aspirar la muestra de sangre, adecuadamente homogeneizada, hasta la señal de 1.

3º. Limpiar, con una gasa, la sangre adherida al exterior de la pipeta.

4º. Aspirar el líquido de dilución hasta la señal de 101 de la pipeta.

5º. Agitar la pipeta, con movimientos de suave inversión, durante unos 5 minutos.

6º. Desechar las 5 primeras gotas de dilución que salen de la pipeta.

7º. Cargar, correctamente, una cámara de recuento, con la dilución de sangre que queda en la pipeta.

8º. Colocar la cámara de recuento cargada, en el interior de una cámara húmeda.

     Se puede preparar una cámara húmeda con una placa de Petri cerrada, en cuyo interior se deposita un papael de filtro enbebido en agua.

9º. Dejar reposar la cámara de recuento cargada, durante 15 minutos.

     La cámara húmeda evita el secamiento de la dilución de sangre presente en la cámara de recuento y el reposo asegura la sedimentación completa de todas las plaquetas.

10º. Colocar la cámara de recuento sobre la pletina del microscopio.

11º. Enfocar uno de los retículos de la cámara de recuento, con un objetivo de bajo aumento (con el de 10 x).

        Con este objetivo se observa la homogeneidad de la distribución celular, de forma que, si ésta no es satisfactoria, se efectá una nueva dilución de la muestra.

12º. Enfocar uno de los cuadrados grandes del retículo ( por ejemplo, el central) con el objetivo de mediano aumento (con el de 40 x).

     Si se utiliza un microscopio normal, las plaquetaas se viualizan mejor situando el condensador ligeramente bajo.

    - Contar la totalidad de las plaquetas depositadas en ese cuadrado grande.

Lectura de resultados

    Los trombocitos se observan como corpúsculos redondeados u ovalados, de tamaño muy pequeño y muy refringentes. Hay que procurar no confundirlos con leucocitos, restos eritrocitarios y, sobre todo, con particulas de polvo.

    Para calcular el número de plaquetas por mm3 de sangre, se aplica la siguiente fórmula:

    PLT / mm3 = P x V x D = P x 1000

- PLT/mm3 = Número de plaquetas por mm3 de sangre.

- P = Número de plaquetas contadas en un cuadrado grande.

- V = Correción de volumen (10).

- D = Corrección de dilución (100).

    Si la cifra de plaquetas obtenida es, sospechosamente, muy reducida, se efectúa una dilución menor de la muestra y se cuentan los trmbocitos depositados en varios cuadrados grandes.

    Por el contrario, si la cifra de plaquetas obtenida es, sospechosamente, muy elevada, se  efectúa una dilución mayor de la muestra.

    Esto implica un ajuste de los cálculos necesarios para obtener el PLT/mm3 y tiene por objeto el confirmar los resultados obtenidos.

Hoja de trabajo

1º. ¿Qué tipo de pipeta diluidora se utiliza en el recuento de plaquetas?.

     Una pipeta diluidora de Thoma para globulos rojos.

2º. ¿Qué función desempeña el líquido de dilución empleado?.

     Este líquido rompe los hematíes, evita la agregación de las plaquetas entre sí y su adhesión a otros elementos, y facilita la visualización de las plaquetas al hacerlas refringentes.

3º. ¿Cuánto líquido de dilución se necesita para efectuar un ensayo?.

     1 ml de líquido de dilución.

4º. ¿Con qué se puede preparar una cámara húmeda?.

     Con una placa de Petri y papel de filtro húmedo.

5º. ¿Con qué objetivo se cuentan las plaquetas?.

     Con el objetivo de 40 x.

6º. ¿Cómo se aprecian los trombocitos en este recuento?.

     Refringentes.

Resultados obtenidos

• Número de plaquetas contadas en un cuadro grande:
• Número de plaquetas por mm3 de sangre:

Valoración de los resultados

El número de plaquetas obtenido es ....

RECUENTO DE LEUCOCITOS (WBC) Práctica XXVII del libro

RECUENTO DE LEUCOCITOS  (WBC)

METÓDICA

Fundamento

   El recuento de leucocitos (WBC) consiste en la determinación del número de leucocitos presentes en un volumen determinado de sangre (generalmente 1mm3).

Material necesario:

• El mismo que en el recuento de hematies, pero la pipeta diluidora de Thoma ha de ser para globulos blancos. (con la bolita interior blanca).
• Un tubo de goma con boquilla, adaptable a la pipeta diluidora.
• Una cámara de recuento, con un retículo tipo Neubauer mejorado.
• Un cubre (hay unos cubres especiales para su uso en recuentos con cámara).
• Un microscopio.

Reactivos

• El líquido de dilución más utilizado es el de Turck, que se compone de las siguientes sustancias:

     - 2 ml de ácido acético glacial.

     - 1 ml de solución acuosa de violeta de genciana al 1%.

     - 100 ml de agua destilada.

     El ácido acético produce lisis de los eritrocitos sin altera a los leucocitos.

     El violeta de genciana tiñe el núcleo de los leucocitos para que éstos puedan observarse mejor. El violeta de genciana puede ser sustituido por azul de metileno.

Muestra

• Sangre capilar obtenida por punción del pulpejo de un dedo o sangre venosa procedente de una punción venosa y anticoagulada con EDTA.

Técnica

     Es la misma que en el recuento de hematíes, pero se cuentan los leucocito presentes en los 4 cuadros grandes de las esquinas del retículo (cada uno de ellos esta dividido a su vez 16 cuadros medianos).

     Si los leucocitos se ven bien, se pueden contar con el objetivo de 10x.

 

Lectura de resultados

     Como se cuentan los leucocitos presentes en 4 cuadros grandes, hay que dividir por 4 la cifra obtenida en el recuento, para calcular el número de leucocitos que hay en un cuadrado grande.

     Como la longitud de cada uno de los lados de los cuadrados grandes es de 1 mm, y la longitud del espacio comprendido entre éstos y el cubre es de 0,1 mm; hay que multiplicar por 10 el resultado anterior, para determinar el número de leucocitos existentes, no en 0,1 mm3, sino en 1 mm3.

     Como la sangre previamente al recuento propiamente dicho se diluye, hay que multiplicar el resultado anterior por 10, si se ha partido de la sangre entera contenida hasta el enrase de 1, o por 20, si se ha partido de sangre entera contenida hasta el enrase de 0,5.

     En definitiva, para su cálculo puede emplearse la siguiente fórmula:

                      WBC = L / 4 x 10 x D

WBC = recuento de leucocitos (número de leucocitos por mm3 de sangre).
L = leucocitos contados en 4 cuadrados grandes.
D factor de dilución (10 ó 20).

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

     La disminución del WBC se produce en las leucopenias, su aumento se da en la leucocitosis.

     Se considera normal un WBC comprendido entre 5.000 y 11.000 leucocitos / mm3 de sangre.

 1 L = 57,  2L = 94,  3L = 252, 4L = 52
 TOTAL =    455 leucocitos

                           WBC = 455/4 x 10 x 10
                           WBC = 113,5 x 10 x 10
                           WBC = 11375 leucocitos / mm3

Hoja de trabajo

1º. ¿Cuál es el líquido de dilución utilizado en WBC?
     El líquido de Turck

2º. ¿Para qué sirve el violeta de genciana que contiene el líquido de dilución?.
     Para teñir el núcleo de los leucocitos para poder verlos mejor.

3º. ¿Con qué objetivo se pueden contar con los leucocitos?.
     Con el objetivo de 10 x ( si se ven, bien) o con el de 40 x.

4º. Si la sangre se diluye a 1/10 y se cuentan 100 leucocitos en 2 cuadrados grandes periféricos, ¿ Cuál es el WBC obtenido?.
     5000 leucocitos / mm3.

Resultados obtenidos

.- Leucocitos contados en los 4 cuadrados grandes periféricos:
   1 L = 57,  2L = 94,  3L = 252, 4L = 52

.- Factor de dilución:
   10.

.- WBC:
    11.375 leucocitos / mm3 de sangre.

Valoración de los resultados:

El WBC obtenido es: Alto  (hay leucocitosis).