DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS Práctica XXXIII del libro pag:257

DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS

INTRODUCCIÓN

     Las crioglobulinas son inmunoglobulinas aisladas o complejos inmunes que están alterados. Esta alteración hace que se vuelvan insolubles y precipiten en el suero cuando están expuestas a una temperatura inferior a la normal del cuerpo humano ( unos 37 ºC).

     Antes o durante el proceso de precipitación, también se pueden producir una fijación de componentes del complemento a la crioglobulina.

     Se distinguen 3 clases crioglobulinas:

• Crioglobulinas tipo I.

     Consiste en una inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM) (paraproteína)

     Se encuentra en el suero a una concentración (> 5 mg/ml).

• Crioglobulinas tipo II.

     Son complejos de una inmunoglobulina monoclonal  (de clase IgM) y de otra policlonal (generalmente de clase IgG) que funciona como antigeno (Ag).

 
     Se hallan en el suero a una concentración mediana (1-5 mg/ml).

• Crioglobulinas tipo III.

     Son las que se producen más frecuentemente.

     Están formadas por 2 inmunoglobulinas policlónicas (habitualmente una de la clase IgG y otra de la clase IgM). Ademas suelen incluir un componente de complemento.

     Su concentración sérica es muy baja (< 80 microgramos/ml).

METÓDICA

Fundamento

     La detección de crioglobulinas se basa en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja (unos 4 ºC, pues ésta es la temperatura a la que las crioglobulinas precipitan más).

     Si el suero problema contiene crioglobulinas, éstas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta el aspecto de partículas blanquecinas.

Material

• Una pipeta Pasteur.
• Un tubo de ensayo.
• Una gradilla.
• Una nevera.
• Un baño de agua.
• Un capilar de microhematocrito no heparinizado.
• Plastilina.
• Una centrífuga de microhematocrito.
• Una regla o un lector de microhematocrito.

Muestra

• Suero transparente, obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal, y separado del coagulo en un ambiente cálido.

     Es importante evitar que la coagulaciòn se produzaca en un ambiente frío, pues esto puede dar lugar a la formación de una pequeña contidad de crioglobulinas.

Técnica

1. Depositar el suero problema en un tubo de ensayo.
2. Colocar el tubo que contiene el suero problema en una nevera, de forma que esté a una temperartura comprendida entre los 4 y los 6 ºC.
3. Examinar el tubo a los 30 minutos y después cada día, durante 6 días.

 Lectura de resusltados

• Si aparecen partículas blanquecinas en el suero, éste ha de ser incubado a 37 ºC.

     Cuando no desaparecen las partículas, traas la incubación, se considera que éstas se deben a restos de fibrina.
     Sin embargo, cuando las partículas desaparecen, se estima que son crioglobulinas precipitadas (prueba positiva).

• El grado dd positividad de la prueba puede ser establecido de la siguiente manera:

ASPECTO DEL SUERO	GRADO DE POSITIVIDAD
Discretamente turbio	+
Francamente turbio	++
Lechoso	+++

     En el caso de que la prueva sea positiva, puede realizarse una semicuantificación de las crioglobulinas presentes en el suero, mediante determinación del criocrito.

     Éste se mide de la siguiente manera:

1. Llenar un tubo capilar de hematocrito con el suero problema, hasta l las 3/4 partes de su longitud.
2. Sellar con plastilina el extremo del tubo por el que ha entrado el suero.
3. Enfriar el tubo a 4 o 6 ºC, hasta que se produzca la precipitación máxima de las crioglobulinas.
4. Centrifugar el tubo a una 12000 g durante 5 minutos.
5. Calcular el porcentaje que supone la columna de pre ipitado, con respecto a la columna total del suero.

     El criocrito es, por lo tanto, la relación existente entre el volumen ocupado por el precipitado de crioglobulinas y el ocupado por el suero total, expresada en forma de porcentaje.



INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

     Las crioglobulinemias tipo I se asocian a transtornos proliferativos (mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström y leucemia linfática crónica.

     Las crioglobulemias tipo II pueden ser idiopáticas o secundarias a distintas enfermedades (transtornos proliferativos, conectivopatías,  hepatopatías crónicas, etc.).

     Las crioglobulinemias tipo III suelen etar relacionadas con infecciones sistémicas y con procesos autoinmunes (glomerulonefritis, lupus eritomatoso deseminado, etc.).

     Las manifestaciones clínicas de las crioglobulinemias se deben a los siguientes fenómenos originados por ellas:

• Aumento de la viscosidad de la sangre.

     Esto puede conducir a una estasis sanguínea en algunos vasos coporales (por ejemplo, en los retinianos y en los conjuntivales) y contribuye a la aparción de transtornos isquémicos.

• Precipitación de las crioglobulinas.

     Se produce en los vasos sanguíneos más distales, pues en éstos la temperatura normal es algo menos que en el resto del cuerpo (30-31 ºC), y es favorecida por la exposición a temperaturas ambientales bajas.

     Origina una obstrucción vascular, que puede ocasionar una acrocianosis, un fenómeno de Raynaud e incluso una isquemia digital con necrosis.

• Depósito de inmunoclomplejos.

     Puede ser causa de la aparición de daños renales (glomerulonefritis) o articulares.

Hoja de trabajo

1. ¿A qué temperatura se debe someter el suero en una detección de crioglobulinas?. Entre 4 y 6 ªC.
2. Si el precipitado no se reabsobe con calor, ¿de qué sustancia está formado?. Fibrina.
3. ¿Cuantas cruces se le asigna  a un suero que adquiere un aspecto lechoso?. 3 cruces.
4. ¿A qué concentración sérica suelen encontrarse las crioglobulinas tipo I?. A > 5 mg/ml.
5. ¿Qué manifestaciones clínicas puede producir una crioglobulinemia?. Aumento de la viscosidad de la sangre, precipitación de las crioglobulinas, depósito de inmunoclomplejos.

Resultados obtenidos

Después de una hora, no había precipitados, 

Valoración de los resultados

En el suero porblema no hay crioglobulinas

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA Práctica XL pag 348 del libro

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

INTRODUCCIÓN

    Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick).

    Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protrombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP determinado en el plasma problema.

METÓDICA

Fundamento

    Para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una baterúia de diluiciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normas no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.

   Tras ello, se asigna el 100 % de actividad al número en segundos  medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.

    Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina), anotando, en el eje de ordenadas ( el valor vertical), los valores, en segundos, del TP del p`lasma control no diluido y de cada ima de sis diluciones y, en el eje de abcisas (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

Material necesario

•  8 tubos de ensayo de plástico.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una pipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1000 µl) de capacidad de dispensación.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200  µl (las de color amarillo).
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37 ºC.
• Un bolígrafo.
• Una regla.
• Una hoja de papel milimetrado. Tambien se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
• Una gradilla.

Reactivos 

•  Solución salina al 0,85 % o, mejor aún, tampón Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:

      Dietil-barbiturato de sodio.................2,94 g

      Acetato de sodio...............................1,94 g

      Agua destilada c.s.p...........................100 ml

• Una tromboplastina cálcica ( por ejemplo, el reactivo Thromboplastin-D preparado or los laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la casa comercial Ral).
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los laboratorios Pacific Hemostasis).

      A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85 % o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	1/2	1/3	1/4	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

     Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asigando a cada dilución.

Técnica

1. Homogeneizar la trmboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
2. Atemperar la tromboplastina cálcina que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado. 
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37 ºC. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37 ºC,  entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50, el de otra con el 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
6. Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
7. Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37 ºC, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar, sucesivamente, cada una de los 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

     Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

     Cuando se forma el coágulo, el cuagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de los resultados

     El TP es el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

     Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

     Para construir la curva de actividad de la protrombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas de la y (el vertical), los vlores, en segundos, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones, y, en el eje de abscisas o de la x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

     Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.

Columna1	Columna2
100	5
50	21
33	29,3
25	41,7
10	47,6

Hoja de trabajo

1. ¿Con que se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?. Con solución salina al 0,85 %.
2. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?. El 50%.
3. ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?. Al agregar la tromboplatina cálcica.
4. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?. Los segundos.