PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA Práctica XL del libro, 6-03-2015

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA.

Fundamento.
Debemos realizar una bateria de diluciones,para obtener con el coagulometro el TP del plasma puro y de cada una de sus diluciones para realizar la curva.

Material.

• 8 tubos de ensayo de plástico.
• Rotulador de vidrio.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml.
• Una micripipeta de 100 y 200 microlitros.
• 7 puntas de micropipeta.
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Una gradilla.

Reactivos.

• Solución salina al 90 %.
• Una tromboplastina cálcica.
• Un pool de plasma normales.

Procedimiento.

Lo primero que hicimos en el pool de plasma, tomamos plasma congelado de otros años los atemperamos a 37º y los añadimos todos en un vaso de precipitados, y por último lo añadimos en los tubos de spenderfor.

Después tomamos 5 tubos de ensayo de plástico y los rotulamos con el porcentaje de actividad asignado a cada dilución que serían un tubo rotulado con 100 , otro con el de  50, otro con el de  33, otro con  25 y el último con el de 10 %.

Al tubo rotulado con % de actividad 100 le añadimos con una micropipeta 200 microlitros de pool de plasma; al tubo 50 le añadimos 200 microlitros de pool de plasma y 200 microlitros de solución salina al 0,85 %; al tubo 33 le añadimos 200 microlitros de pool de plasma y 400 microlitros de solución salina al 0,85%; al tubo 25 le añadimos 200 microlitros de pool de plasma y 600 microlitros de solución salina al 0,85%; al tubo 10 le añadimos 200 micrilitros de pool de plasma y con una pipeta graduada de vidrio le añadimos 1,8 ml de solución salina al 0,85%.

Cuando ya tenemos los 5 tubos con pool de plasma y solución salina, con una micropipeta vertemos 100 microlitros de plasma puro y de cada una de sus diluciones en las cubetas rotuladas con el %de actividad que le corresponde. A cada una de las 5 cubetas le añadimos un trocito de acero.

Estas cinco cubetas las colocamos en la celdas que hay en el coagulómetro y en otra cubeta añadimos tromboplastina cálcica. En el coagulómetro le tenemos que añadir a cada cunbeta 200 microlitros de tromboplastina calcica.

Hoja de trabajo:

.

1º. ¿Con qué se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?

Con solución salina al 0,85 %

2º. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?

 50 % de actividad.

3º. ¿ Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?

Añadiendo a las diluciones 200 microlitros de tromboplastina cálcica.

4º. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?

Los valores en segundos del TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones.

Resultado obtenido.

	Tiempo de Protrombina (PT)
Plasma control no diluido (de 100% deACTIVIDAD)	12 segundos
Plasma control diluido a 1/2 (de 50% de actividad)	19 segundos.
Plasma control diluido a 1/3 (de 33% de actividad)	25,3 segundos.
Plasma control diluido a 1/4 (de 25% de actividad)	32,4 segundos.
Plasma control diluido a 1/10 (de 10% de actividad)	65,1 segundos.

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA Práctica XL pag 348 del libro

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

INTRODUCCIÓN

    Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick).

    Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protrombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP determinado en el plasma problema.

METÓDICA

Fundamento

    Para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una baterúia de diluiciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normas no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.

   Tras ello, se asigna el 100 % de actividad al número en segundos  medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.

    Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina), anotando, en el eje de ordenadas ( el valor vertical), los valores, en segundos, del TP del p`lasma control no diluido y de cada ima de sis diluciones y, en el eje de abcisas (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

Material necesario

•  8 tubos de ensayo de plástico.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una pipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1000 µl) de capacidad de dispensación.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200  µl (las de color amarillo).
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37 ºC.
• Un bolígrafo.
• Una regla.
• Una hoja de papel milimetrado. Tambien se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
• Una gradilla.

Reactivos 

•  Solución salina al 0,85 % o, mejor aún, tampón Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:

      Dietil-barbiturato de sodio.................2,94 g

      Acetato de sodio...............................1,94 g

      Agua destilada c.s.p...........................100 ml

• Una tromboplastina cálcica ( por ejemplo, el reactivo Thromboplastin-D preparado or los laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la casa comercial Ral).
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los laboratorios Pacific Hemostasis).

      A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85 % o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	1/2	1/3	1/4	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

     Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asigando a cada dilución.

Técnica

1. Homogeneizar la trmboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
2. Atemperar la tromboplastina cálcina que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado. 
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37 ºC. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37 ºC,  entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50, el de otra con el 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
6. Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
7. Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37 ºC, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar, sucesivamente, cada una de los 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

     Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

     Cuando se forma el coágulo, el cuagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de los resultados

     El TP es el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

     Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

     Para construir la curva de actividad de la protrombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas de la y (el vertical), los vlores, en segundos, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones, y, en el eje de abscisas o de la x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

     Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.

Columna1	Columna2
100	5
50	21
33	29,3
25	41,7
10	47,6

Hoja de trabajo

1. ¿Con que se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?. Con solución salina al 0,85 %.
2. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?. El 50%.
3. ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?. Al agregar la tromboplatina cálcica.
4. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?. Los segundos.