ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS Práctica XXII del libro pag 140 28-01-2015

ELECTROFORESIS DE HEMOGLOBINAS

Fundamento:

Para detectar qué tipos de hemoglobina hay en sangre, y así detectar las posibles anemias o tipos de anemias.

Material:

-Tiras de cellogel

-Aplicador de electroforesis semicírculo

-Rodillo

-Bandeja

-Cubetas de plástico

-Fuente de alimentación

-Placa de vidrio

-Centrifugadora
-Pipeta de 5ml

Reactivos:

-Agua destilada

-Suero fisiológico

-Ácido acético 5%(solución decolorante)

-Metanol,ciclohexanona, ac.acético glacial (solución transparentadora)

-Cloroformo

-Metanol

-Tampón ph 8.8

-Negro amido (colorante)

Técnica:

-PRIMERA PARTE DE LA TÉCNICA

-Preparación de hemolizado: 

1.     Preparamos 3ml de sangre.

2.     Lo centrifugamos a 3000 rpm unos 10 minutos.

3.     Retiramos el sobrenadante con una pipeta pasteur de cristal y le echamos 4-5 ml de suero salino. 

4.     Homogeneizamos bien con pipeta pasteur que hemos comprobado que da mejor resultado que con un agitador magnético.

5.     Lo introducimos de nuevo a la centrifugadora 5 min (en clase hemos centrifugado 10 minutos porque con 5 se quedaba el proceso sin terminar).

6.     Volvemos a repetir este paso de lavado unas 3 veces consecutivas.

Se repite la operación pero esta vez lo hemolizamos con cloroformo y agua destilada (medimos el volumen de hematíes y se le añade media parte de cloroformo que lo introducimos en la cámara de seguridad y parte y media de agua destilada.

Ejemplo: si de hematíes hay un volumen de 1ml,hechamos 0,5 de cloroformo y 1,5 ml de agua destilada.
 

-2ª PARTE DE LA TÉCNICA:

1      Introducimos tiras cellogel en cubeta boca arriba en tampón durante 10 min que se empapen bien.

2      Colocamos las tiras en el puente, lo introducimos en cubeta y colocamos nuestra muestra en la tira haciendo una fina raya de sangre. Le aplicamos la fuente de alimentación a 400v durante 15 min. (porque con 10min no nos a salido bien).

3      Colocamos las tiras boca abajo en:
-bandeja con negro amido   10 min (tinción)

-bandeja con ácido. acético 5% 10 min(decoloración)se repite 3 veces.
-bandeja con metanol 1 min (deshidratación)
-bandeja con solución transparentadora 2-3 min (transparentación).

4   Después se colocan las tiras en una placa de vidrio y las alisamos con un rodillo, con la parte absorbente boca abajo.

5      Metemos en la estufa unos 60-70ºC unos 5-6 min hasta que las tiras queden transparentes del todo.

Resultados:

6      -Hemoglobina A.

INDICES ERITROCITARIOS Práctica XVIII pag 102 del libro 26-01-2015

INDICES ERITROCITARIOS

Justificación de la técnica y metodología utilizada

Esta práctica se realiza para calcular el VCM, HCM y CHCM

Identificación de la muestra y de los controles efectuados

Sangre venosa o capilar con anticoagulante

Material utilizado

·      Capilares

·      Gasas

·      Lancetas

·      Cámara de recuento

·      Cubetas de espectrofotómetro

·      Pipeta Pasteur 

·       

Reactivos

·      Alcohol

·      Líquido de hayem 

·      Agua destilada

·      Hemoglobin cal

·      Hemoglobin 50x

Secuenciación y procedimiento

1.      Realizar la práctica del recuento en cámara de glóbulos rojos y anotar el resultado

2.      Realizar la práctica del hematocrito y anotar el resultado

3.      Realizar la práctica de la determinación de hemoglobina y anotar el resultado

4.      Con los resultados obtenidos hacer las fórmulas

Descripción y registro de los resultados

Volumen corpuscular medio (VCM)
VCM = HCT/RBC X 10      VCM = 20/2300000X10=8,69X10 ^-5

Hemoglobina corpuscular media (HCM)
HCM=Hb/RBCX10          HCM=19,2/2300000X10=8,35X10^-5

Concentración hemoglobínica corpuscular media (CHCM)

CHCM=Hb/HCTX100  

CHCM=19,2/18,52X100=103,67 → Hay hipercromía 

DETERMINACIÓN DE LA SIDEREMIA Práctica XIX (fotocopia de valentin) pag 112 del libro. Fecha 22-01-2015

DETERMINACIÓN DE LA SIDEREMIA

Fundamento:  

Determinación de la cantidad de hierro con el espectrofotómetro y aplicando la fórmula.

Material: 

·         Centrífuga,
·         tubos  de ensayo,
·         gradilla,
·         micropipeta,
·         puntas de micropipeta,
·         espectrofotómetro,
·         rotulador de vidrio,
·         cubetas de espectrofotómetro.

Reactivos:  

·         R1 tampón (acetato pH 4'9, 100mmol/l),
·         R2 reductor (ácido ascórbico, 99'7%),
·         R3 color (FerroZine, 40mmol/l), Iron Cal (patrón primario acuoso de Hierro, 100 microgramos por decilitro). 

Muestra: 

Sangre venosa anticoagulada con EDTA

Desarrollo: 

-Colocamos dos tubos de ensayo en la centrífuga (uno con la sangre problema y otro con agua destilada, los dos con la misma cantidad).

-Una vez sacados de la centrífuga, retiramos el sobrenadante (plasma)  y lo colocamos en un tubo de ensayo.

-En cada tubo de ensayo, con el rotulador de vidrio, le escribimos lo que contendrá :

1.       blanco RT,

2.      Patrón,

3.      Blanco muestra y

4.       muestra).

-Preparamos el RT: Disolvemos el contenido de un tubo de R2 reductor en un frasco de R1 tampón, lo tapamos y lo mezclamos suavemente HASTA disolver su contenido.

-Preparamos los tubos de ensayo de la siguiente manera: 

	Blanco RT	Patrón	Blanco muestra	Muestra
RT (ml)	1	1	1	1
R3 (gotas)	1	1	--	1
Agua destilada (µl)	200	--	--	--
Patrón (µl)	--	200	--	--
Muestra (µl)	--	--	200	200

-Después de mezclarlos, los incubamos durante 5 minutos a 37ºC, o 10 minutos a temperatura ambiente.

-En cada una de las cubetas escribimos lo mismo que en en los tubos de ensayo y le añadimos lo de los tubos de ensayo.

-Preparamos el espectrofotómetro para la absorbancia con las siguiente condiciones

:

·         Longitud de onda: 562nm (en nuestro caso será 540nm que es la máxima que nos permite nuestro espectrofotómetro)

·         Volumen: 100

·         Temperatura: 0

·         Tiempo: 0

-Colocamos cada una de las cubetas en su orden (blanco, patrón ) para que el espectrofotómetro vaya absorbiendo.

-Anotamos las absorbancias que salgan.

Observaciones: 

El resultado que ha salido es muy bajo ya que la sangre utilizada lleva mucho tiempo en la nevera.

Resultados: 

Absorbancias:

·         Blanco RT = 0;

·         Patrón=0'059;

·         Blanco muestra= 1'503;

·         Muestra=1'507

Interpretación de los resultados: 

Los valores normales son:

·         Hombre entre 65 y 175 microgramos/dl

·         Mujeres entre 40 y 150 microgramos /dl.

Nuestro resultado es inferior a los valores normales, eso se puede deber a una anemia ferropénica o a un anemia de las afecciones crónicas. 

Hoja de trabajo

1. ¿Cuál es el reactivo cromógeno de esta técnica? El reactivo cromógeno es el R3 (FerroZine) que es el que da color.
2. ¿Porqué tenemos un tubo BR?.
3. ¿Qué muestras no son válidas? No son válidas las muestras lipémicas o hemolizadas.
4.  ¿En qué unidades se mide la sideremia? La sideremia se mide en microgramos por decilitro.