Cuaderno de prácticas HEMATOLOGIA: PCR - DETERMINACIÓN DE IDENTIDAD GENÉTICA 13-14 Y 15/05/2015

PRÁCTICA DE LA PCR

MATERIAL NECESARIO

· 1 Tubo espendorf
· Tubo de cristal 5ml
· Pipetas de 2 y 3 ml
· Micropipetas
· Gradillas
· Microcentrifuga
REACTIVOS
· Solución salina
· Matriz instagene
· Tubo Ready to Go
· Oligo1
· Oligo2

TÉCNICA

1. Con un isopo o palillo frotamos en las paredes de la boca para recoger CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL

2. Lo metemos en 3 ml solución salina en tubo y agitamos durante unos segundos, para pasar todo el material genético a la solución salina.

3. Después con una pipeta pasamos 1,4 ml a un microtubo (eppendorf)

4. Ponemos en la microcentrifuga a 8000 rpm/ 5 min.

5. Decantar sobrenadante con couidado

6. Añadimos 70 µl MATRIZ INSTAGENTE y resuspender (mezclar) con la punta de la micropipeta

7. Incubar 10 min. A 100 ºC en baño seco

8. Enfriar a Tº ambiente

9. Centrifugar 1300 rpm/ 30 seg

10. Pasar 10 µl sobrenadante a microtubo → CONGELADOR

11. Tubo Ready to Go PCR

12. Añadimos 18,5 µl de agua destilada

13. Añadimos 2 µl de oligo1

14. Añadimos 2 µl de oligo2

15. Añadimos 2,5 µl de ADN

16. Un golpe de centrifugamos

17. Lo metemos en el PCR, en el cual ira subiendo y bajando la temperatura para desnaturalizar y romper la cadena de ADN y volver a hacer una copia de de ADN únicamente del fragmento que queremos (ya esto está hecho con los reactivos que hemos añadido), esta operación durara sobre unas 2 horas.

HACEMOS GEL DE AGAROSA

1) Echamos 3 ml de tampón TAE 10 x ( Tris Acetato Edta 10 x )

2) Echamos 27 ml de agua destilada

3) Echamos 0,45 gr. De agarosa

4) Con toda la mezcla anterior (pasos 1,2 y 3) obtenemos una dilución al 1,5 % de agarosa.

5) Cogemos la mezcla y la calentamos durante al menos 20 seg. Sacamos y movemos, si no se ha disuelto repetimos la operación hasta que esté bien disuelto.

6) Cuando se ha disuelto bien dejamos que baje la temperatura, (a temperatura ambiente ), y añadimos SOLUCIÓN COLORANTE DE ÁCIDO NUCLÉICO 2 ml.

MUESTRAS