PCR - DETERMINACIÓN DE IDENTIDAD GENÉTICA 13-14 Y 15/05/2015

PRÁCTICA DE LA PCR

MATERIAL NECESARIO

· 1 Tubo espendorf
· Tubo de cristal 5ml
· Pipetas de 2 y 3 ml
· Micropipetas
· Gradillas
· Microcentrifuga
REACTIVOS
· Solución salina
· Matriz instagene
· Tubo Ready to Go
· Oligo1
· Oligo2

TÉCNICA

1.                  Con un isopo o palillo frotamos  en las paredes de la boca para recoger CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL

2.                  Lo metemos en 3 ml solución salina en tubo y agitamos durante unos segundos, para pasar todo el material genético a la solución salina.

3.                  Después con una pipeta pasamos 1,4 ml a un microtubo  (eppendorf)

4.                  Ponemos en la microcentrifuga a 8000 rpm/ 5 min.

5.                  Decantar sobrenadante con couidado

6.                  Añadimos 70 µl MATRIZ  INSTAGENTE y resuspender (mezclar) con la punta de la micropipeta

7.                  Incubar 10 min. A 100 ºC  en baño seco

8.                  Enfriar a Tº ambiente

9.                  Centrifugar 1300 rpm/ 30 seg

10.              Pasar 10 µl sobrenadante a microtubo → CONGELADOR

11.              Tubo Ready to Go PCR

12.              Añadimos 18,5 µl de agua destilada

13.              Añadimos 2 µl de oligo1

14.              Añadimos 2 µl de oligo2

      15.             Añadimos 2,5 µl de ADN

16.              Un golpe de centrifugamos

17.              Lo metemos en  el PCR, en el cual ira subiendo y bajando la temperatura para desnaturalizar y romper la cadena de ADN y volver a hacer una copia de de ADN únicamente del fragmento que queremos (ya esto está hecho con los reactivos que hemos añadido), esta operación durara sobre unas 2 horas.

HACEMOS GEL DE AGAROSA

1)      Echamos 3  ml de tampón TAE 10 x ( Tris Acetato Edta 10 x )

2)      Echamos 27 ml de agua destilada

3)      Echamos 0,45 gr. De agarosa

4)      Con toda la mezcla anterior (pasos 1,2 y 3) obtenemos una dilución al 1,5 % de agarosa.

5)      Cogemos la mezcla y la calentamos durante al menos 20 seg. Sacamos y movemos, si no se ha disuelto repetimos la operación hasta que esté bien disuelto.

6)      Cuando se ha disuelto bien dejamos que baje la temperatura, (a temperatura ambiente ), y añadimos SOLUCIÓN COLORANTE DE ÁCIDO NUCLÉICO 2 ml.

 MUESTRAS

• Primer eppendof:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga
• Segundo eppendof: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga

 

DESAROLLO DEL ULTIMO PROCESO

 

1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa

2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente

3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .

4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo

5.Añadimos el tampón TAE

6.Añadimos control en las esquinas

7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.

8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos

9.Visualizamos los fragmentos de ADN  en luz ultravioleta

 

 

DETERMINACIÓN DE UN Du. Práctica LXII del libro, pag 581, 20-05-2015

DETERMINACIÓN DE UN Du

Fundamento:  

 

Realizar la prueba de Coombs indirecta, para observar en la sangre problema si existe un antígeno D débil (Du)
Material:   

• tubos de centrífuga, 
• centrífuga, 
• pipetas pasteur, 
• gradilla, 
• baño de agua,reloj

Reactivos:  

• Suero Anti-D,
• suero de Coombs,
• suero fisiológico

Muestra:

• Hematíes de la sangre problema en suspensión al 5%

Técnica: 
1.-En un tubo, añadimos una gota de suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes al 5% y lo mezclamos suavemente
2.-Incubamos el tubo a 37ºC durante 30-45 minutos.
3.-Después de incubar realizamos lavado de los hematíes, de la siguiente manera:

• En el tubo añadimos suero fisiologico (unos 4 ml) y añadimos en otro agua destilada para compensar.
• Centrifugamos el tubo a 2.000 rpm durante 4 minutos
• Después de centrifugar, retiramos el sobrenadante
• Repetimos el proceso dos veces mas
• Decantamos por completo el sobrenadante final.

4.-Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente.

5.-Centrifugamos el tubo a 1.000 rpm durante 1 minuto
6.-Observamos si existe aglutinación
Observaciones:  

Para evitar falsos positivos (si existe aglutinación) debido a una sensibilización de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes del problema. Este nos servirá como control negativo.
Resultados: 

Interpretación de los resultados:   

Si aglutina el resultado es positivo, por lo tanto la sangre problema contiene el antígeno Du. En caso de no salir aglutinación el Rh será negativo. En nuestro caso los hematíes no han aglutinado, por lo tanto nuestra sangre problema es Rh negativo.
Hoja de trabajo
1.¿Qué contiene el suero de Coombs? El suero de Coombs contiene anticuerpos antiglobulina humana
2.¿Qué se detecta con la prueba directa? Detectamos anticuerpos incompletos que han sensibilizado los hematíes in vivo
3.¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta? Detectamos anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes
4.¿Qué buscamos en la sangre del paciente? Buscamos si puede tener un antígeno D débil
5.¿Qué ocurre si el control es positivo? Ha habido una sensibilización prévia de los hematíes in vivo, por lo que los resultados no son válidos.

Prueba cruzada mayor practica LXIV Pag 602 del libro 22-05-2015

  PRUEBA CRUZADA MAYOR

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante , primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso y por último frente al suero antiglobulina de Coombs. con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados en la membrana eritrocitaria.

Es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores en la técnica.

Material necesario

• Tubos de hemólisis
• Centrífuga
• Baño de agua y
• Pipetas pasteur
• Gradilla
• Reloj
• Reactivos
• Solución salina fisiológica
• Albúmina bovina al 30  %
• Suero antiglobulina de coombs

Muestra

Suero del receptor obtenida de sangre coagulada y libre de hemólisis debe de ser fresco menos de 24 horas desde la extracción y conservado a 4 grados centígrados

Hematíes del donante previamente lavado tres veces en solución salina fisiológica y resuspendidos en ella al 2-5%.

Técnica

1. En un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del donante y 2 gotas  dé suero del receptor.

2. Mezclamos suavemente y dejamos a temperatura ambiente durante 2 ó 3  minutos.

3. Centrifugamos a 3000 r.p.m durante 30 segundos.

4. Leemos el resultado obtenido en medio salino.

5. Añadimos al tubo 3 gotas de albumina bovina al 30%.

6. Mezclamos bien e incubamos a 37º C durante 30 minutos.

7. Centrifugamos a 3000 rpm. durante 1 minuto.

8. Leemos el resultado obetenido en medio albuminoso.

9. Lavamos 3 veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retiramos bien todo el sobrenadante del último lavado.

10. Añadimos al tubo una gota de antiglobulina humana de Coombs. Mezclamos bien.

11. Centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos.

12. Leemos los resultados.

Lectura de resultados obtenidos

La lectura de los resultados  se realiza resuspendiendo el boton hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones.

En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40 X.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos.

La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y por tanto, la transfusión es posible.

La algutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.

Si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, tambien indica incompatibilidad.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada Mayor?. Suero del paciente (receptor), con hematíes del lavados previamente 3 veces del donante.
2. Cuando se debe realizar la prueba cruzada menor?. Se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa.
3. ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoso?. Para detectar todos los anticuerpos presentes.
4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs?. Los anticuerpos que se hayan queado fijados en la membrana eritrocitaria.

Resultados obtenidos:

Coagulación en medio salino.

Valoración de los resultados:

Las sangres analizadas son incompatibles.