PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA
INTRODUCCIÓN
Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick).
Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protrombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP determinado en el plasma problema.
METÓDICA
Fundamento
Para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una baterúia de diluiciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normas no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.
Tras ello, se asigna el 100 % de actividad al número en segundos medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.
Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina), anotando, en el eje de ordenadas ( el valor vertical), los valores, en segundos, del TP del p`lasma control no diluido y de cada ima de sis diluciones y, en el eje de abcisas (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.
Material necesario
- 8 tubos de ensayo de plástico.
- Un rotulador de vidrio de punta fina.
- Una pipeta de seguridad.
- Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1000 µl) de capacidad de dispensación.
- Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200 µl (las de color amarillo).
- 5 cubetas de coagulómetro.
- 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
- Un coagulómetro.
- Un baño de agua ajustable a 37 ºC.
- Un bolígrafo.
- Una regla.
- Una hoja de papel milimetrado. Tambien se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
- Una gradilla.
- Solución salina al 0,85 % o, mejor aún, tampón Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:
Acetato de sodio...............................1,94 g
Agua destilada c.s.p...........................100 ml
- Una tromboplastina cálcica ( por ejemplo, el reactivo Thromboplastin-D preparado or los laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la casa comercial Ral).
- Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los laboratorios Pacific Hemostasis).
Pool de plasmas o
Plasma control (en µl)
|
200
|
200
|
200
|
200
|
200
|
Solución salina al 0,85 %
o tampón de Michaelis
(en µl)
|
0
|
200
|
400
|
600
|
1.800
|
Dilución
|
1/1
|
1/2
|
1/3
|
1/4
|
1/10
|
% de actividad
|
100
|
50
|
33
|
25
|
10
|
Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asigando a cada dilución.
Técnica
- Homogeneizar la trmboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
- Atemperar la tromboplastina cálcina que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado.
- Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37 ºC. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37 ºC, entre 5 y 15 minutos.
- Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
- Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50, el de otra con el 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
- Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
- Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37 ºC, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
- Colocar, sucesivamente, cada una de los 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.
Cuando se forma el coágulo, el cuagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.
Lectura de los resultados
El TP es el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.
Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.
Para construir la curva de actividad de la protrombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas de la y (el vertical), los vlores, en segundos, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones, y, en el eje de abscisas o de la x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.
Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.
| Columna1 | Columna2 |
| 100 | 5 |
| 50 | 21 |
| 33 | 29,3 |
| 25 | 41,7 |
| 10 | 47,6 |
Hoja de trabajo
- ¿Con que se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?. Con solución salina al 0,85 %.
- ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?. El 50%.
- ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?. Al agregar la tromboplatina cálcica.
- ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?. Los segundos.
