DETERMINACIÓN DE LA SIDEREMIA Práctica XIX (fotocopia de valentin) pag 112 del libro. Fecha 22-01-2015

DETERMINACIÓN DE LA SIDEREMIA

Fundamento:  

Determinación de la cantidad de hierro con el espectrofotómetro y aplicando la fórmula.

Material: 

·         Centrífuga,
·         tubos  de ensayo,
·         gradilla,
·         micropipeta,
·         puntas de micropipeta,
·         espectrofotómetro,
·         rotulador de vidrio,
·         cubetas de espectrofotómetro.

Reactivos:  

·         R1 tampón (acetato pH 4'9, 100mmol/l),
·         R2 reductor (ácido ascórbico, 99'7%),
·         R3 color (FerroZine, 40mmol/l), Iron Cal (patrón primario acuoso de Hierro, 100 microgramos por decilitro). 

Muestra: 

Sangre venosa anticoagulada con EDTA

Desarrollo: 

-Colocamos dos tubos de ensayo en la centrífuga (uno con la sangre problema y otro con agua destilada, los dos con la misma cantidad).

-Una vez sacados de la centrífuga, retiramos el sobrenadante (plasma)  y lo colocamos en un tubo de ensayo.

-En cada tubo de ensayo, con el rotulador de vidrio, le escribimos lo que contendrá :

1.       blanco RT,

2.      Patrón,

3.      Blanco muestra y

4.       muestra).

-Preparamos el RT: Disolvemos el contenido de un tubo de R2 reductor en un frasco de R1 tampón, lo tapamos y lo mezclamos suavemente HASTA disolver su contenido.

-Preparamos los tubos de ensayo de la siguiente manera: 

	Blanco RT	Patrón	Blanco muestra	Muestra
RT (ml)	1	1	1	1
R3 (gotas)	1	1	--	1
Agua destilada (µl)	200	--	--	--
Patrón (µl)	--	200	--	--
Muestra (µl)	--	--	200	200

-Después de mezclarlos, los incubamos durante 5 minutos a 37ºC, o 10 minutos a temperatura ambiente.

-En cada una de las cubetas escribimos lo mismo que en en los tubos de ensayo y le añadimos lo de los tubos de ensayo.

-Preparamos el espectrofotómetro para la absorbancia con las siguiente condiciones

:

·         Longitud de onda: 562nm (en nuestro caso será 540nm que es la máxima que nos permite nuestro espectrofotómetro)

·         Volumen: 100

·         Temperatura: 0

·         Tiempo: 0

-Colocamos cada una de las cubetas en su orden (blanco, patrón ) para que el espectrofotómetro vaya absorbiendo.

-Anotamos las absorbancias que salgan.

Observaciones: 

El resultado que ha salido es muy bajo ya que la sangre utilizada lleva mucho tiempo en la nevera.

Resultados: 

Absorbancias:

·         Blanco RT = 0;

·         Patrón=0'059;

·         Blanco muestra= 1'503;

·         Muestra=1'507

Interpretación de los resultados: 

Los valores normales son:

·         Hombre entre 65 y 175 microgramos/dl

·         Mujeres entre 40 y 150 microgramos /dl.

Nuestro resultado es inferior a los valores normales, eso se puede deber a una anemia ferropénica o a un anemia de las afecciones crónicas. 

Hoja de trabajo

1. ¿Cuál es el reactivo cromógeno de esta técnica? El reactivo cromógeno es el R3 (FerroZine) que es el que da color.
2. ¿Porqué tenemos un tubo BR?.
3. ¿Qué muestras no son válidas? No son válidas las muestras lipémicas o hemolizadas.
4.  ¿En qué unidades se mide la sideremia? La sideremia se mide en microgramos por decilitro.

DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE Práctica XVII del libro. pag 95 19/01/2015

DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE

INTRODUCCIÓN

     La determinación de la hemoglobina en sangre es un paso fundamental en el diagnóstico de las anemias. Por ello se exige que el método sea preciso y fiable.

     Existen varios métodos para su determinación, aunque todos ellos se basan en las propiedades fisicoquímicas de la  molécula de hemoglobina. Los más utilizados se fundamentan en la capacidad para obsorber lúz de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como la oxihemoglobina o la cianmetahemoglobina.

     El comité internacional para la estandarización de la Hematología recomienda el método clorimétrico de la cianmetahemoglobina por su exactitud y precisión, y por la posibilidad de utilizar un patrón de referencia internacional muy estable que sirve para verificar los resultados obtenidos en el laboratorio, y elaborar curvas de calibración.

     El método de la oxihemoglobina es más rápido y simple, pero no dispone de un patrón de oxihemoglobina estable.

METÓDICA

Extracto de la metódica  DRABKIN de la casa SPINREACT.

Fundamento

    Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos:

     En primer lugar el Fe2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro potásico, se oxida a Fe3+, dando lugar a la metahemoglobina.

     Posteriormente, y en presencia de cianuro potásico, la metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina. Ëste es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos clorimétricos empleando un patrón de concentración conocida.

Material necesario

Espectofotometro
Cubetas
Pipeta
Micropipeta
4 Tubo de ensayo
Agua destilada
Vaso de precipitado
Papel de filtro
3 tubos de hemolisis

REACTIVOS

• Hemoglobin 50x que esta hecho por: 

 - ferricianuro de potasio 0.60mmol/L
 - Cianuro de potasio 77mmol/L
 - Dihidrogeno fosfato de potasio 2mmol/L
 - Hemoglobin cal

MUESTRA

• Sangre venosa

FUNDAMENTO

     La hemoglobina es oxidada por la acción del ferrocianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.

     La intensidad de color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.

TÉCNICA

Se hace el reactivo de trabajo añadiendo el bote de R2 al frasco de R1 , lo agitamos y ponemos el nombre
Preparamos el patrón que esta compuesto por tres fases : 

1.añadimos en un tubo de ensayo 250 ul(1 patrón y tarro normal)

2.Añadimos en otro tubo de ensayo 250 ul y 250 agua destilada(2 patrón 1/2)a continuación vamos mezclando la muestra con una pipeta pasteur 

3.Añadimos en un tubo de ensayo 250 ul y 250 ml de agua y lo mezclamos 4.Cogemos otros dos tubos y añadimos en cada uno de ellos diferente sangre (la primera sangre es cojida del frigorífico y es 0+ y la segunda muestra es sangre de valentin 0+)

Cogemos tres tubos de ensayo, los rotulamos con (blanco , patrón y muestra)

	Blanco	Patrón	Muestra
RT (ml)	2,5	2,5	2,5
Calibrador (µl)	--	10	--
Muestra (µl)	--	--	10

Lo dejamos reposar durante 3 minutos
Leemos los resultados en el espectrofotometro.

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

Los valores normales son:

Hombres: 14 - 18 g/dl.
Mujeres:  11 - 16 g/dl.
Niños:     10 - 14 g/dl.

En este caso, es preferible hablar de valores de referencia, ya que existen diferencias notables  entre zonas geográficas y grupos étnicos donde existen ciertas anemias carenciales que afectan a un número elevado de la población.

HOJA DE TRABAJO

1. ¿En que se basan los métodos de determinación de la hemoglobina?. Se basan en las propiedades fisioquimicas de la molécula de hemoglobina.
2. ¿Cúal es el método recomendado por el Comité Internaional para la estandarización de la Hemoglobina?. El método más recomendado ees el método colorimétrico de la cianometahemoglobina.
3. ¿De dónde procede el 20 de la fórmula para calcular la concentración?. Es la preparación estandar de la cianmetahemoglobina equivalente a una concentración de hemoglobina de 20 g/dl, de Drabkin.

Resultados obtenidos

Hb	Absorbancia
15	0,136
7,5	0,069
3,75	0,056

   

(Muestra 1) Y = 0,0074x +  0,0225 0,238 = 0,0074x + 0,0225 0,238 – 0,0225 = 0,0074x 0,2155 = 0,0074x X = 0,2155/0,0074 X = 29,12 g/dl

(Muestra 2) Y = 0,0074x + 0,0225 0,143 = 0,0074x + 0,0225 0,143 – 0,0225 = 0,0074x 0,1175 = 0,0074x X =0,1175/0,0074 X = 15,87 g/dl

Valoración de los resultados

- La primera muestra su resultado es muy elevado, esto puede ser por la sangre en mal estado ( mucho tiempo en el frigorífico)

- La segunda muestra su resultado esta dentro de los valores permitidos 15,87 g/dl, entre (14-18 g/dl).

DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS Práctica XXXIII del libro pag:257

DETECCIÓN DE CRIOGLOBULINAS

INTRODUCCIÓN

     Las crioglobulinas son inmunoglobulinas aisladas o complejos inmunes que están alterados. Esta alteración hace que se vuelvan insolubles y precipiten en el suero cuando están expuestas a una temperatura inferior a la normal del cuerpo humano ( unos 37 ºC).

     Antes o durante el proceso de precipitación, también se pueden producir una fijación de componentes del complemento a la crioglobulina.

     Se distinguen 3 clases crioglobulinas:

• Crioglobulinas tipo I.

     Consiste en una inmunoglobulina monoclonal (IgG o IgM) (paraproteína)

     Se encuentra en el suero a una concentración (> 5 mg/ml).

• Crioglobulinas tipo II.

     Son complejos de una inmunoglobulina monoclonal  (de clase IgM) y de otra policlonal (generalmente de clase IgG) que funciona como antigeno (Ag).

 
     Se hallan en el suero a una concentración mediana (1-5 mg/ml).

• Crioglobulinas tipo III.

     Son las que se producen más frecuentemente.

     Están formadas por 2 inmunoglobulinas policlónicas (habitualmente una de la clase IgG y otra de la clase IgM). Ademas suelen incluir un componente de complemento.

     Su concentración sérica es muy baja (< 80 microgramos/ml).

METÓDICA

Fundamento

     La detección de crioglobulinas se basa en la exposición del suero problema a la acción de una temperatura baja (unos 4 ºC, pues ésta es la temperatura a la que las crioglobulinas precipitan más).

     Si el suero problema contiene crioglobulinas, éstas precipitan con el frío, y el precipitado formado adopta el aspecto de partículas blanquecinas.

Material

• Una pipeta Pasteur.
• Un tubo de ensayo.
• Una gradilla.
• Una nevera.
• Un baño de agua.
• Un capilar de microhematocrito no heparinizado.
• Plastilina.
• Una centrífuga de microhematocrito.
• Una regla o un lector de microhematocrito.

Muestra

• Suero transparente, obtenido de sangre coagulada completamente a temperatura corporal, y separado del coagulo en un ambiente cálido.

     Es importante evitar que la coagulaciòn se produzaca en un ambiente frío, pues esto puede dar lugar a la formación de una pequeña contidad de crioglobulinas.

Técnica

1. Depositar el suero problema en un tubo de ensayo.
2. Colocar el tubo que contiene el suero problema en una nevera, de forma que esté a una temperartura comprendida entre los 4 y los 6 ºC.
3. Examinar el tubo a los 30 minutos y después cada día, durante 6 días.

 Lectura de resusltados

• Si aparecen partículas blanquecinas en el suero, éste ha de ser incubado a 37 ºC.

     Cuando no desaparecen las partículas, traas la incubación, se considera que éstas se deben a restos de fibrina.
     Sin embargo, cuando las partículas desaparecen, se estima que son crioglobulinas precipitadas (prueba positiva).

• El grado dd positividad de la prueba puede ser establecido de la siguiente manera:

ASPECTO DEL SUERO	GRADO DE POSITIVIDAD
Discretamente turbio	+
Francamente turbio	++
Lechoso	+++

     En el caso de que la prueva sea positiva, puede realizarse una semicuantificación de las crioglobulinas presentes en el suero, mediante determinación del criocrito.

     Éste se mide de la siguiente manera:

1. Llenar un tubo capilar de hematocrito con el suero problema, hasta l las 3/4 partes de su longitud.
2. Sellar con plastilina el extremo del tubo por el que ha entrado el suero.
3. Enfriar el tubo a 4 o 6 ºC, hasta que se produzca la precipitación máxima de las crioglobulinas.
4. Centrifugar el tubo a una 12000 g durante 5 minutos.
5. Calcular el porcentaje que supone la columna de pre ipitado, con respecto a la columna total del suero.

     El criocrito es, por lo tanto, la relación existente entre el volumen ocupado por el precipitado de crioglobulinas y el ocupado por el suero total, expresada en forma de porcentaje.



INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

     Las crioglobulinemias tipo I se asocian a transtornos proliferativos (mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenström y leucemia linfática crónica.

     Las crioglobulemias tipo II pueden ser idiopáticas o secundarias a distintas enfermedades (transtornos proliferativos, conectivopatías,  hepatopatías crónicas, etc.).

     Las crioglobulinemias tipo III suelen etar relacionadas con infecciones sistémicas y con procesos autoinmunes (glomerulonefritis, lupus eritomatoso deseminado, etc.).

     Las manifestaciones clínicas de las crioglobulinemias se deben a los siguientes fenómenos originados por ellas:

• Aumento de la viscosidad de la sangre.

     Esto puede conducir a una estasis sanguínea en algunos vasos coporales (por ejemplo, en los retinianos y en los conjuntivales) y contribuye a la aparción de transtornos isquémicos.

• Precipitación de las crioglobulinas.

     Se produce en los vasos sanguíneos más distales, pues en éstos la temperatura normal es algo menos que en el resto del cuerpo (30-31 ºC), y es favorecida por la exposición a temperaturas ambientales bajas.

     Origina una obstrucción vascular, que puede ocasionar una acrocianosis, un fenómeno de Raynaud e incluso una isquemia digital con necrosis.

• Depósito de inmunoclomplejos.

     Puede ser causa de la aparición de daños renales (glomerulonefritis) o articulares.

Hoja de trabajo

1. ¿A qué temperatura se debe someter el suero en una detección de crioglobulinas?. Entre 4 y 6 ªC.
2. Si el precipitado no se reabsobe con calor, ¿de qué sustancia está formado?. Fibrina.
3. ¿Cuantas cruces se le asigna  a un suero que adquiere un aspecto lechoso?. 3 cruces.
4. ¿A qué concentración sérica suelen encontrarse las crioglobulinas tipo I?. A > 5 mg/ml.
5. ¿Qué manifestaciones clínicas puede producir una crioglobulinemia?. Aumento de la viscosidad de la sangre, precipitación de las crioglobulinas, depósito de inmunoclomplejos.

Resultados obtenidos

Después de una hora, no había precipitados, 

Valoración de los resultados

En el suero porblema no hay crioglobulinas

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA Práctica XL pag 348 del libro

PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE ACTIVIDAD DE LA PROTROMBINA

INTRODUCCIÓN

    Los resultados de una determinación del tiempo de protrombina (TP) pueden expresarse en forma de porcentaje de actividad (indice de Quick).

    Para ello es necesario preparar, previamente, una curva de actividad de la protrombina y, posteriormente, interpolar en la gráfica trazada el valor en segundos del TP determinado en el plasma problema.

METÓDICA

Fundamento

    Para construir una curva de actividad de la protrombina se prepara una baterúia de diluiciones, a partir de un plasma control normal, y se mide el TP del plasma control normas no diluido y de cada una de las diluciones preparadas.

   Tras ello, se asigna el 100 % de actividad al número en segundos  medidos en la determinación del TP del plasma control normal puro, y se calcula el porcentaje que, proporcionalmente, les corresponde a los valores de TP determinados en cada una de las diluciones de éste.

    Con todos estos datos, se traza una curva de calibrado (curva de actividad de la protrombina), anotando, en el eje de ordenadas ( el valor vertical), los valores, en segundos, del TP del p`lasma control no diluido y de cada ima de sis diluciones y, en el eje de abcisas (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

Material necesario

•  8 tubos de ensayo de plástico.
• Un rotulador de vidrio de punta fina.
• Una pipeta de seguridad.
• Una pipeta graduada de vidrio de 1 ml (1000 µl) de capacidad de dispensación.
• Una pipeta automática capaz de dispensar 100 y 200  µl (las de color amarillo).
• 5 cubetas de coagulómetro.
• 5 trocitos de acero especiales para depositar en el interior de las cubetas.
• Un coagulómetro.
• Un baño de agua ajustable a 37 ºC.
• Un bolígrafo.
• Una regla.
• Una hoja de papel milimetrado. Tambien se puede utilizar un papel gráfico especial (por ejemplo, el Quick-Graph de los Laboratorios bioMérieux).
• Una gradilla.

Reactivos 

•  Solución salina al 0,85 % o, mejor aún, tampón Michaelis. Este último puede prepararse de la siguiente forma:

      Dietil-barbiturato de sodio.................2,94 g

      Acetato de sodio...............................1,94 g

      Agua destilada c.s.p...........................100 ml

• Una tromboplastina cálcica ( por ejemplo, el reactivo Thromboplastin-D preparado or los laboratorios Pacific Hemostasis y distribuido por la casa comercial Ral).
• Un pool de plasmas normales o un plasma control normal (por ejemplo, el Plasma Control Normal de los laboratorios Pacific Hemostasis).

      A partir del pool de plasmas o del plasma control normal se debe preparar una batería de diluciones, de la siguiente manera:

Pool de plasmas o Plasma control (en µl)	200	200	200	200	200
Solución salina al 0,85 % o tampón de Michaelis (en µl)	0	200	400	600	1.800
Dilución	1/1	1/2	1/3	1/4	1/10
% de actividad	100	50	33	25	10

     Los tubos han de ser rotulados con la cuantía de la dilución que contienen o con el porcentaje de actividad asigando a cada dilución.

Técnica

1. Homogeneizar la trmboplastina cálcica y las diluciones de plasma, sin agitarlas bruscamente.
2. Atemperar la tromboplastina cálcina que se va a necesitar en un tubo de ensayo de plástico, adecuadamente rotulado. 
3. Atemperar la tromboplastina cálcica, a 37 ºC. Para ello, se sitúa el tubo que contiene esta sustancia en un baño de agua, ajustado a 37 ºC,  entre 5 y 15 minutos.
4. Introducir un trocito de acero apropiado en 5 cubetas de coagulómetro.
5. Rotular el extremo superior de una cubeta con el % de actividad de 100, el de otra con el de 50, el de otra con el 33, el de otra con el de 25 y el de otra con el de 10.
6. Verter 100 µl de plasma puro y de cada una de sus diluciones en el interior de las cubetas rotuladas con el % de actividad que les corresponde.
7. Incubar el plasma, contenido en cada cubeta, a 37 ºC, entre 3 y 5 minutos. Para ello, pueden depositarse las cubetas en la placa calefactora del coagulómetro.
8. Colocar, sucesivamente, cada una de los 5 cubetas, en la celda de medida del coagulómetro, y agregar 200 µl de tromboplastina cálcica.

     Al agregar la tromboplastina cálcica, se pone en marcha el magnetoagitador del coagulómetro y comienza la lectura de éste.

     Cuando se forma el coágulo, el cuagulómetro finaliza la lectura y nos ofrece en su pantalla el tiempo transcurrido desde la adición de la tromboplastina cálcica.

Lectura de los resultados

     El TP es el tiempo transcurrido desde la adicción de la tromboplastina cálcica hasta la formación del coágulo de fibrina.

     Lo más correcto es determinar 3 veces el TP el plasma control puro y cada una de sus diluciones, y dar, como resultado final, la cifra media calculada a partir de cada trío de valores.

     Para construir la curva de actividad de la protrombina hay que trazar una curva de calibrado o de referencia, en un papel milimetrado. Para ello se anotan, en el eje de ordenadas de la y (el vertical), los vlores, en segundos, de TP del plasma control no diluido y de cada una de sus diluciones, y, en el eje de abscisas o de la x (el horizontal), el % de actividad asignado a cada uno de ellos.

     Posteriormente, se señalan en la gráfica los puntos en que confluyen cada uno de los valores de TP con su % de actividad correspondiente. Finalmente, se dibuja la línea que mejor une los 5 puntos. Si la gráfica se traza en un papel milimetrado normal, se obtiene una curva.

Columna1	Columna2
100	5
50	21
33	29,3
25	41,7
10	47,6

Hoja de trabajo

1. ¿Con que se diluye el pool de plasmas normales o el plasma control normal?. Con solución salina al 0,85 %.
2. ¿Qué porcentaje de actividad se asigna a la dilución del plasma control de 1/2?. El 50%.
3. ¿Cuándo se pone en marcha la lectura del coagulómetro?. Al agregar la tromboplatina cálcica.
4. ¿Qué se anota en el eje de ordenadas?. Los segundos.