DETERMINACIÓN DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE
INTRODUCCIÓN
La determinación de la hemoglobina en sangre es un paso fundamental en el diagnóstico de las anemias. Por ello se exige que el método sea preciso y fiable.
Existen varios métodos para su determinación, aunque todos ellos se basan en las propiedades fisicoquímicas de la molécula de hemoglobina. Los más utilizados se fundamentan en la capacidad para obsorber lúz de la hemoglobina o alguno de sus derivados, como la oxihemoglobina o la cianmetahemoglobina.
El comité internacional para la estandarización de la Hematología recomienda el método clorimétrico de la cianmetahemoglobina por su exactitud y precisión, y por la posibilidad de utilizar un patrón de referencia internacional muy estable que sirve para verificar los resultados obtenidos en el laboratorio, y elaborar curvas de calibración.
El método de la oxihemoglobina es más rápido y simple, pero no dispone de un patrón de oxihemoglobina estable.
METÓDICA
Extracto de la metódica DRABKIN de la casa SPINREACT.
Fundamento
Se basa en la transformación de la hemoglobina en cianmetahemoglobina mediante los siguientes pasos:
En primer lugar el Fe2+ de la hemoglobina, en presencia de ferricianuro potásico, se oxida a Fe3+, dando lugar a la metahemoglobina.
Posteriormente, y en presencia de cianuro potásico, la metahemoglobina pasa a cianmetahemoglobina. Ëste es un compuesto estable, de color rojo, con un pico de absorción máximo a 540 nm y cuya concentración puede ser determinada por métodos clorimétricos empleando un patrón de concentración conocida.
Material necesario
Cubetas
Pipeta
Micropipeta
4 Tubo de ensayo
Agua destilada
Vaso de precipitado
Papel de filtro
3 tubos de hemolisis
REACTIVOS
- Hemoglobin 50x que esta hecho por:
- Cianuro de potasio 77mmol/L
- Dihidrogeno fosfato de potasio 2mmol/L
- Hemoglobin cal
MUESTRA
- Sangre venosa
FUNDAMENTO
La hemoglobina es oxidada por la acción del ferrocianuro a metahemoglobina y mediante el cianuro se convierte en cianmetahemoglobina.
La intensidad de color formado es proporcional a la concentración de hemoglobina presente en la muestra ensayada.
TÉCNICA
Se hace el reactivo de trabajo añadiendo el bote de R2 al frasco de R1 , lo agitamos y ponemos el nombre
Preparamos el patrón que esta compuesto por tres fases :
1.añadimos en un tubo de ensayo 250 ul(1 patrón y tarro normal)
2.Añadimos en otro tubo de ensayo 250 ul y 250 agua destilada(2 patrón 1/2)a continuación vamos mezclando la muestra con una pipeta pasteur
3.Añadimos en un tubo de ensayo 250 ul y 250 ml de agua y lo mezclamos 4.Cogemos otros dos tubos y añadimos en cada uno de ellos diferente sangre (la primera sangre es cojida del frigorífico y es 0+ y la segunda muestra es sangre de valentin 0+)
Cogemos tres tubos de ensayo, los rotulamos con (blanco , patrón y muestra)
Blanco
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Patrón
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Muestra
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RT (ml)
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2,5
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2,5
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2,5
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Calibrador (µl)
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--
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10
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--
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Muestra (µl)
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--
|
--
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10
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Lo dejamos reposar durante 3 minutos
Leemos los resultados en el espectrofotometro.
INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS
Los valores normales son:
Hombres: 14 - 18 g/dl.
Mujeres: 11 - 16 g/dl.
Niños: 10 - 14 g/dl.
En este caso, es preferible hablar de valores de referencia, ya que existen diferencias notables entre zonas geográficas y grupos étnicos donde existen ciertas anemias carenciales que afectan a un número elevado de la población.
HOJA DE TRABAJO
Los valores normales son:
Hombres: 14 - 18 g/dl.
Mujeres: 11 - 16 g/dl.
Niños: 10 - 14 g/dl.
En este caso, es preferible hablar de valores de referencia, ya que existen diferencias notables entre zonas geográficas y grupos étnicos donde existen ciertas anemias carenciales que afectan a un número elevado de la población.
HOJA DE TRABAJO
- ¿En que se basan los métodos de determinación de la hemoglobina?. Se basan en las propiedades fisioquimicas de la molécula de hemoglobina.
- ¿Cúal es el método recomendado por el Comité Internaional para la estandarización de la Hemoglobina?. El método más recomendado ees el método colorimétrico de la cianometahemoglobina.
- ¿De dónde procede el 20 de la fórmula para calcular la concentración?. Es la preparación estandar de la cianmetahemoglobina equivalente a una concentración de hemoglobina de 20 g/dl, de Drabkin.
| Hb | Absorbancia |
| 15 | 0,136 |
| 7,5 | 0,069 |
| 3,75 | 0,056 |
(Muestra 1)
Y = 0,0074x + 0,0225
0,238 = 0,0074x + 0,0225
0,238 – 0,0225 = 0,0074x
0,2155 = 0,0074x
X = 0,2155/0,0074
X = 29,12 g/dl
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(Muestra 2)
Y = 0,0074x + 0,0225
0,143 = 0,0074x + 0,0225
0,143 – 0,0225 = 0,0074x
0,1175 = 0,0074x
X =0,1175/0,0074
X = 15,87 g/dl
|
Valoración de los resultados
- La primera muestra su resultado es muy elevado, esto puede ser por la sangre en mal estado ( mucho tiempo en el frigorífico)
- La segunda muestra su resultado esta dentro de los valores permitidos 15,87 g/dl, entre (14-18 g/dl).
