PCR - DETERMINACIÓN DE IDENTIDAD GENÉTICA 13-14 Y 15/05/2015

PRÁCTICA DE LA PCR

MATERIAL NECESARIO

· 1 Tubo espendorf
· Tubo de cristal 5ml
· Pipetas de 2 y 3 ml
· Micropipetas
· Gradillas
· Microcentrifuga
REACTIVOS
· Solución salina
· Matriz instagene
· Tubo Ready to Go
· Oligo1
· Oligo2

TÉCNICA

1.                  Con un isopo o palillo frotamos  en las paredes de la boca para recoger CÉLULAS DE LA MUCOSA BUCAL

2.                  Lo metemos en 3 ml solución salina en tubo y agitamos durante unos segundos, para pasar todo el material genético a la solución salina.

3.                  Después con una pipeta pasamos 1,4 ml a un microtubo  (eppendorf)

4.                  Ponemos en la microcentrifuga a 8000 rpm/ 5 min.

5.                  Decantar sobrenadante con couidado

6.                  Añadimos 70 µl MATRIZ  INSTAGENTE y resuspender (mezclar) con la punta de la micropipeta

7.                  Incubar 10 min. A 100 ºC  en baño seco

8.                  Enfriar a Tº ambiente

9.                  Centrifugar 1300 rpm/ 30 seg

10.              Pasar 10 µl sobrenadante a microtubo → CONGELADOR

11.              Tubo Ready to Go PCR

12.              Añadimos 18,5 µl de agua destilada

13.              Añadimos 2 µl de oligo1

14.              Añadimos 2 µl de oligo2

      15.             Añadimos 2,5 µl de ADN

16.              Un golpe de centrifugamos

17.              Lo metemos en  el PCR, en el cual ira subiendo y bajando la temperatura para desnaturalizar y romper la cadena de ADN y volver a hacer una copia de de ADN únicamente del fragmento que queremos (ya esto está hecho con los reactivos que hemos añadido), esta operación durara sobre unas 2 horas.

HACEMOS GEL DE AGAROSA

1)      Echamos 3  ml de tampón TAE 10 x ( Tris Acetato Edta 10 x )

2)      Echamos 27 ml de agua destilada

3)      Echamos 0,45 gr. De agarosa

4)      Con toda la mezcla anterior (pasos 1,2 y 3) obtenemos una dilución al 1,5 % de agarosa.

5)      Cogemos la mezcla y la calentamos durante al menos 20 seg. Sacamos y movemos, si no se ha disuelto repetimos la operación hasta que esté bien disuelto.

6)      Cuando se ha disuelto bien dejamos que baje la temperatura, (a temperatura ambiente ), y añadimos SOLUCIÓN COLORANTE DE ÁCIDO NUCLÉICO 2 ml.

 MUESTRAS

• Primer eppendof:9 ul de ADN replicado + i ul de tampón de carga
• Segundo eppendof: 4.5 ul de ladder + 0.5 ul de tampón de carga

 

DESAROLLO DEL ULTIMO PROCESO

 

1.Colocamos cinta adhesiva en la cubeta donde se va a depositar agarosa

2.Depositamos agarosa lentamente para que no se produzcan burbujas y lo dejamos actuar unos 30 minutos aproximadamente

3.Retiramos las dos peines y lo colocamos en la bandeja de fuente de alimentación .

4.Los palillos deben estar en cátodo , y la muestra debe moverse hacia el ánodo

5.Añadimos el tampón TAE

6.Añadimos control en las esquinas

7.A continuación ,depositamos en pocillos la muestra , 9 ul de DNA + 1 ul de tampón de carga.

8.Una vez llenados los palillos conectamos los cables en la fuente de alimentación y aplicamos una corriente de 120 voltios durante 30 minutos

9.Visualizamos los fragmentos de ADN  en luz ultravioleta

 

 

DETERMINACIÓN DE UN Du. Práctica LXII del libro, pag 581, 20-05-2015

DETERMINACIÓN DE UN Du

Fundamento:  

 

Realizar la prueba de Coombs indirecta, para observar en la sangre problema si existe un antígeno D débil (Du)
Material:   

• tubos de centrífuga, 
• centrífuga, 
• pipetas pasteur, 
• gradilla, 
• baño de agua,reloj

Reactivos:  

• Suero Anti-D,
• suero de Coombs,
• suero fisiológico

Muestra:

• Hematíes de la sangre problema en suspensión al 5%

Técnica: 
1.-En un tubo, añadimos una gota de suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes al 5% y lo mezclamos suavemente
2.-Incubamos el tubo a 37ºC durante 30-45 minutos.
3.-Después de incubar realizamos lavado de los hematíes, de la siguiente manera:

• En el tubo añadimos suero fisiologico (unos 4 ml) y añadimos en otro agua destilada para compensar.
• Centrifugamos el tubo a 2.000 rpm durante 4 minutos
• Después de centrifugar, retiramos el sobrenadante
• Repetimos el proceso dos veces mas
• Decantamos por completo el sobrenadante final.

4.-Añadimos sobre el sedimento hemático una gota de suero de Coombs y mezclamos suavemente.

5.-Centrifugamos el tubo a 1.000 rpm durante 1 minuto
6.-Observamos si existe aglutinación
Observaciones:  

Para evitar falsos positivos (si existe aglutinación) debido a una sensibilización de los hematíes in vivo, debemos realizar una prueba de Coombs directa con los hematíes del problema. Este nos servirá como control negativo.
Resultados: 

Interpretación de los resultados:   

Si aglutina el resultado es positivo, por lo tanto la sangre problema contiene el antígeno Du. En caso de no salir aglutinación el Rh será negativo. En nuestro caso los hematíes no han aglutinado, por lo tanto nuestra sangre problema es Rh negativo.
Hoja de trabajo
1.¿Qué contiene el suero de Coombs? El suero de Coombs contiene anticuerpos antiglobulina humana
2.¿Qué se detecta con la prueba directa? Detectamos anticuerpos incompletos que han sensibilizado los hematíes in vivo
3.¿Qué podemos detectar con la prueba indirecta? Detectamos anticuerpos incompletos libres en el suero, o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes
4.¿Qué buscamos en la sangre del paciente? Buscamos si puede tener un antígeno D débil
5.¿Qué ocurre si el control es positivo? Ha habido una sensibilización prévia de los hematíes in vivo, por lo que los resultados no son válidos.

Prueba cruzada mayor practica LXIV Pag 602 del libro 22-05-2015

  PRUEBA CRUZADA MAYOR

Consiste en enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante , primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso y por último frente al suero antiglobulina de Coombs. con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados en la membrana eritrocitaria.

Es importante respetar los tiempos de incubación para evitar posibles errores en la técnica.

Material necesario

• Tubos de hemólisis
• Centrífuga
• Baño de agua y
• Pipetas pasteur
• Gradilla
• Reloj
• Reactivos
• Solución salina fisiológica
• Albúmina bovina al 30  %
• Suero antiglobulina de coombs

Muestra

Suero del receptor obtenida de sangre coagulada y libre de hemólisis debe de ser fresco menos de 24 horas desde la extracción y conservado a 4 grados centígrados

Hematíes del donante previamente lavado tres veces en solución salina fisiológica y resuspendidos en ella al 2-5%.

Técnica

1. En un tubo de hemólisis depositamos una gota de la suspensión de hematíes del donante y 2 gotas  dé suero del receptor.

2. Mezclamos suavemente y dejamos a temperatura ambiente durante 2 ó 3  minutos.

3. Centrifugamos a 3000 r.p.m durante 30 segundos.

4. Leemos el resultado obtenido en medio salino.

5. Añadimos al tubo 3 gotas de albumina bovina al 30%.

6. Mezclamos bien e incubamos a 37º C durante 30 minutos.

7. Centrifugamos a 3000 rpm. durante 1 minuto.

8. Leemos el resultado obetenido en medio albuminoso.

9. Lavamos 3 veces los hematíes con solución salina para eliminar los anticuerpos que no se han fijado a los eritrocitos. Retiramos bien todo el sobrenadante del último lavado.

10. Añadimos al tubo una gota de antiglobulina humana de Coombs. Mezclamos bien.

11. Centrifugamos a 1000 rpm durante 2 minutos.

12. Leemos los resultados.

Lectura de resultados obtenidos

La lectura de los resultados  se realiza resuspendiendo el boton hemático con suavidad después de cada una de las centrifugaciones.

En caso de reacciones débiles positivas, conviene observar al microscopio entre porta y cubre con objetivo de 40 X.

Interpretación clínica de los resultados obtenidos.

La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que las sangres son compatibles, y por tanto, la transfusión es posible.

La algutinación en cualquiera de las fases de la prueba indica incompatibilidad.

Si se observa hemólisis en cualquiera de los pasos, tambien indica incompatibilidad.

Hoja de trabajo

1. ¿Qué se enfrenta en la prueba cruzada Mayor?. Suero del paciente (receptor), con hematíes del lavados previamente 3 veces del donante.
2. Cuando se debe realizar la prueba cruzada menor?. Se realiza cuando se transfunde una gran cantidad de plasma, ya que en este caso, la presencia de anticuerpos en la sangre del donante puede ser peligrosa.
3. ¿Por qué debemos realizar la prueba en medio salino y albuminoso?. Para detectar todos los anticuerpos presentes.
4. ¿Qué pone de manifiesto el suero antiglobulina de Coombs?. Los anticuerpos que se hayan queado fijados en la membrana eritrocitaria.

Resultados obtenidos:

Coagulación en medio salino.

Valoración de los resultados:

Las sangres analizadas son incompatibles. 
   

Determinación rápida de hemoglobina

Fundamento

Esta determinación rápida de HB se basa en el hecho de que una sangre una concentración HB superior a la permitida para poder efectuar una relación tiene una densidad mayor a la de la solución de sulfato de cobre previamente preparada por lo que en esta circunstancia una gota de la sangre investigada que libremente a través de la solución de sulfato de cobre

Material necesario

• Material de extracción de sangre capilar
• Un vaso de precipitado de 50 mililitros

Reactivos

1º Solución de sulfato de cobre a una densidad de 1, 052 gr/dl  para mujeres y 1,054 para hombres gr/dl.

Para ello lo hacemos de la siguiente forma primero y sobre 17 gramos de sulfato de cobre en 100 mililitros de agua destilada solución madre.

2º Mezclar 51 ml de la solución madre con 49 ml de agua destilada.

Muestra

• sangre capilar

Técnica

1.  Disponer la solución de sulfato de cobre en un vaso de precipitado de 50 mililitros
2.  Recoger una gota de la sangre problema
3. Dejar caer la gota de la sangre problema con algo de impulso sobre la solución de sulfato de cobre

Lectura de resultados

Si la gota de sangre problema es más densa que la solución de sulfato de cobre que libremente a través de ella.

Sin embargo si la gota de sangre problema es menos densa que la solución de sulfato de cobre no caer al fondo del vaso de precipitados que contiene esta solución.

Interpretación de los resultados

Una gota de sangre con más de 12 gr/dl de HB tiene una densidad mayor que 1, 052 gramos/cm3.

Si la gota de sangre problema cae libremente a través de la solución de sulfato de cobre tiene una densidad mayor que 1,52 gramos por centímetro cúbico y por lo tanto tiene una concentración de HB superior a 12 gramos por decilitro.

Si la sangre problema tiene una concentración de HB superior a 12 gramos por decilitro el sujeto puede donar sangre.

En el caso contrario la donación no puede ser efectuada.

Hoja de trabajo

1¿Cuál es el valor mínimo de hemoglobina que debe tener una mujer antes de la donación?  12,5 g/dl en mujeres.
2. ¿Con qué otra solución comparamos la densidad de la sangre? Con solución de sulfato de cobre.

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA Rh, Práctica LXI del libro, pag 578, 07-05-2015

DETERMINACIÓN DEL FENOTIPO Y GENOTIPO DEL SISTEMA  Rh

Fundamento

  Determinar el fenotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema con los sueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-e y anti-c, y con el fenotipo buscar el genotipo más probable.

Material

  Tubos de centrífuga, centrífuga, rotulador de vidrio, pipetas pasteur, gradilla, visualizador luminoso

Reactivos

• Sueros anti-D
• Suero anti-C 
• Suero anti-E 
• Suero anti-c
• Suero anti-e
• Suero salino

Muestra

• Suspensión de hematíes al 5% (véase práctica LX )

Técnica

1. Rotulamos cinco tubos de centrífuga, cada uno con la letra D, C, E, c y e.
2. Añadimos una gota de suspensión de hematíes a cada tubo y una gota del suero correspondiente.
3. Centrifugamos todos los tubos a 1.000 rpm durante 1 minuto
4. Observamos si existe aglutinación o no con e visualizador luminoso

Observaciones

Para observar si existe aglutinación o no, golpeamos suavemente con los dedos en el fondo del tubo par despegar el botón hemático, si existe algutinación se observará grumos de color rojo.

Resultados

Interpretación de los resultados 

En fenotipo obtenido es el siguiente:

Tubo	Aglutinación
D	+
C	-
E	+
c	+
e	+

El/ los posible/s genotipo/s se puede/n obtener mediante esta tabla:

Por lo tanto, los posibles genotipos de la sangre problema son: 

DcE/dce,     DcE/Dce,    Dcee/dcE
Hoja de trabajo:

1. ¿Qué antisueros se utilizan en esta técnica? Los antisueros anti-D, anti-C, anti-E, anti-c y anti-e 
2. ¿Por qué no existe suero anti-d? Porque no existe el antígeno d ni el anticuerpo anti-d
3. ¿Qué expresan los cinco resultados obtenidos? Expresan el fenotipo de la sangre analizada
4. Si la sangre es Rh+, ¿puede determinarse exactamente su genotipo con respecto al sistema Rh? Exactamente no se podría ya que no se puede saber si es Rh + heterozigotico o homozigotico.
5. Si los resultados obtenidos son: D-, C-, E+, c+ y e-; ¿Cuál es el genotipo posible de esta sangre? El genotipo será dcE/dcE.

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO Práctica LX del libro, pag 575, 05/05/2015

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh EN TUBO

Fundamento

 Determinar el grupo Rh de la muestra enfrentándolo al suero anti-D

Material 

Tubos de centrífuga, pipetas pasteur, centrífuga, rotulador de vidrio, gradilla, vasos de precipitado,visualizador luminoso

Reactivos 

• Suero anti-D
• Albúmina bovina al 30% 
• Suero fisiológico

Muestra

• Sangre venosa anticoagulada

Técnica

-Debemos obtener una suspensión de hematíes al 5% de la sangre problema de la siguiente manera:

Añadimos 0'5 ml de la sangre problema en un tubo de centrífuga y lo rellenamos con suero fisiológico.
Lo metemos en la centrífuga, y centrifugamos a 2.000rpm durante 4 minutos.
Extraemos el sobrenadante y repetimos la operación dos veces más.
Después de los tres lavados

-Añadiremos 250 microlitros de hematíes lavados en un tubo con 475 ml de suero salino y homogenizamos.--Rotulamos dos tubos limpios con las letras D y A
-En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y en el tubo A una gota de albúmina bovina al 30%
-A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5% y agitamos suavemente para mezclar el contenido de los tubos.
-Centrifugamos los tubos a 1.000 rpm durante un 1 minuto.
-Después de la centrifugación observamos si ha habido aglutinación en el visualizador luminoso.

Observaciones

El tubo con albúmina es un control negativo, por lo que si resulta una aglutinación el resultado de la prueba no es válido. Para ver si hay aglutinación o no, se debe golpear suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático, si se resuspende es negativo y si se forman grumos de color rojo es positivo.

Resultados:

Interpretación de los resultados 

Los dos tubos se han resuspendido por lo tanto el Rh de la muestra es negativo.

Hoja de trabajo

1. ¿Por qué utilizamos el control de albúmina? Porque el control de albúmina es negativo y así evitamos los falsos positivo.
2. ¿Qué ocurre si no aparece aglutinación en el tubo D? El Rh de la sangre problema es negativo.
3. ¿Qué debemos detectar mediante un Coombs indirecto? Debemos comprobar que el paciente no posee un Du (D débil).
4. ¿Cómo se prepara la muestra problema? Lavando los hematíes de la muestra problema y haciendo una suspensión de hematíes al 5%.

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh PORTA Práctica LIX del libro, pag 573, 05/05/2015

DETERMINACIÓN DEL GRUPO Rh PORTA 

Fundamento 

Determinar el grupo Rh, enfrentando la sangre problema al suero anti-D

Material 

•  Portaobjetos,
•  Palillos agitadores
•  Rotulador de vidrio
•  Lancetas
•  Gasas
•  Visualizador luminoso

Reactivos

• Alcohol, 
• Suero anti-D 
• Albúmina bovina al 30%

Muestra

• Sangre capilar

Técnica  -Dividimos el portaobjetos en dos secciones con el rotulador de vidrio y marcar una con la letra S (de suero) y otro con la letra A (de albúmina).
-Con la lanceta nos pinchamos un dedo, y en cada sección añadimos una gota de sangre.
-Añadimos una gota de suero anti-D en la sección S y una gota de albúmina, en la sección A.
-Con los palillos mezclamos la sangre con el suero y la albúmina.
-Colocamos el porta en un visualizador luminoso y lo agitamos un poco para observarlo.
Observaciones: La aglutinación se favorece con el calor, por lo que es imprescindible colocarlo en el visualizador luminoso para observar si hay aglutinación (aparición de grumos rojos sobre un fondo claro).

Resultados

Interpretación de los resultados 

En la sección S, se puede observar que existe aglutinación, por lo tanto el grupo Rh es positivo.
Hoja de trabajo

1. ¿Qué tipo de muestra empleamos en esta técnica? Utilizamos sangre capilar
2. ¿Para que se utiliza el visualizador? Para observar la aglutinación (si hay) ya que el calor favorece la aglutinación.
3. ¿Qué puede dar lugar a falsas aglutinaciones? Pequeños coágulos de fibrina contenidos en la muestra.
4. ¿Qué ocurre si aglutina la sección A? No se puede informar de los resultados, ya que esta sección debe ser negativa.

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO ABO Práctica LVII del libro, pag 561

DETERMINACIÓN SÉRICA DEL GRUPO ABO

FUNDAMENTO:

El suero de un individuo solo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes.Por ello,al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B,solo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.

Esta técnica puede realizarse tanto en porta como en tubo,aunque se prefiere la determinación en tubo porque la centrifugacion de los hematíes intensifica el fenómeno de aglutinación

MATERIAL:

• Tubo de centrifuga
• Pipeta pasteur
• Baño maría
• Centrifuga
• Reloj
• Rotulador
• Papel de fieltro
• Gradilla
• Guantes
• Micropipeta
• Puntas de micropipeta
• Vaso de precipitado 
• Vaso de precipitado para residuos
• Para film

REACTIVOS:

• Hematíes del grupo A1
• Hematíes del grupo A2
• Hematíes del grupo B
• Hematíes del grupo 0
• Hematíes de la sangre problema

MUESTRA:

Suero

DESARROLLO:

1. Cogemos un 1 ml de sangre con una micropipeta y echamos una cantidad de suero salino
2. Centrifugamos los tubos a 2.000 rpm durante 4 minutos
3. Retiramos el sobrenadante
4. Repetimos dos veces mas el proceso anterior
5. Añadimos en otros 4 tubos dos gotas de sangre de cada grupo y 5 ml de suero fisiológico
6. Rotulamos un tubo de centrifuga con la letra A1; A2;B;0
7. Añadimos a cada tubo dos gotas de suero problema
8. Depositamos una gota de la suspensión de hematíes que se corresponderá con la letra del tubo rotulado.
9. Agitamos suavemente y centrifugamos a 1000 rpm durante 1 minuto
10. Golpeamos suavemente el extremo inferior de los tubos 

RESULTADO:

LECTURA DE LOS RESULTADOS

• Si aparecen unos grumos rojos flotando en un liquido claro indica que existe aglutinación.
• En el caso contrario, los hematíes se resuspenden homogéneamente dando lugar a un liquido de color rojizo

INTERPRETACIÓN CLÍNICA DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS

El grupo eritrocitario que se asignara,atendiendo a los resultados obtenidos,se puede ver en el siguiente cuadro:

Tubo A1	Tubo A2	Tubo B	Tubo 0	Tubo C	ac presentes en el suero	Grupo eritrocitario
-	-	+	-	-	Anti-B	A1
- o +*	-	+	-	-	Anti –B y anti-A	A2
+	+	-	-	-	Anti-A	B
+	+	+	-	-	Anti-A y anti-B	0
-	-	-	-	-	Ninguno	A1B
-o+”	-	-	-	-	Niguno o anti-A1	A2B
+	+	+	+	+	Autoanticuerpos	Initerpretable

+ = Aglutinación

- = No aglutinación

* = Este anti-A1 se encuentra solo en un 2% de los individuos A2

0 = Este resultado se observa solo en el 25% de los individuos A2B

ES difícil confirmar el grupo sanguíneo por esta técnica en el caso los recién nacidos ,ya que sus anticuerpos no están bien desarrollados aun.También encontramos dificultades en los pacientes con agammaglobulinemia,ya que carecen de anticuerpos y en aquellos que poseen otros anticuerpos específicos o inespecificos capaces de reaccionar con los antígenos del grupo ABO

HOJA DE TRABAJO:

1.¿Que son los hematíes tipados?

Los que sabemos de que tipo son.

2.¿A que dilucion empleamos los hematíes del paciente?

5%.

3.¿Que clase de muestra se emplea en esta técnica?

Suero.

4.¿Que ocurre cuando el tubo C presenta aglutinación?

Que hemos cometido algún error.

RESULTADOS OBTENIDOS:

	Aglutinación	No aglutinación
Tubo A1	NO	NO
Tubo A2	NO	NO
Tubo B	NO	NO
Tubo 0	NO	NO
Tubo C	NO	NO

VALORACIÓN DE LOS RESULTADOS:

• Los AC encontrados en el suero son: Nada
• El grupo eritrocitario de la sangre amalizada es: Nada

OBSERVACIONES:

Nos han salido las dos veces negativas , la primera la hemos echo con los hematíes de suspensión de 2.5% , con dos gotas de suero y la segunda vez la hemos echo con 6 gotas de hematíes y 2 de suero y tampoco ha salido aglutinación